蔡 旭，宋啟示，楊劍坤，盧志遠，陳科力，張玉梅*

(1. 湖北中醫(yī)藥大學，教育部中藥資源與中藥復方重點實驗室, 湖北 武漢430065；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室, 云南 昆明650223；3.云南省環(huán)境科學研究院，云南 昆明 650034)

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孔雀柏化學成分研究

蔡 旭1,2，宋啟示2，楊劍坤3，盧志遠2，陳科力1，張玉梅2*

(1. 湖北中醫(yī)藥大學，教育部中藥資源與中藥復方重點實驗室, 湖北 武漢430065；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室, 云南 昆明650223；3.云南省環(huán)境科學研究院，云南 昆明 650034)

目的：研究孔雀柏(Chamaecyparisobtusacv.Tetragon)的化學及活性成分。方法：綜合運用工業(yè)甲醇提取、堿溶酸沉，通過硅膠柱、Sephadex LH-20、C18反相硅膠以及制備液相等色譜方法分離純化，并采用MS和NMR等波譜學方法鑒定化合物結構，測試各化合物的細胞毒活性。結果：分離并鑒定了8個化合物,分別為catechin(1)、taxifolin-3-O-β-D-xylopyranoside(2)、icariside E4(3)、(-)arctigenin(4)、savinin(5)、horsfieldin(6)、dihydrosesamin(7)和skimmin (8)。結論：此8個化合物均為在該植物中首次分離得到。體外細胞毒活性篩選表明，孔雀柏的甲醇提取物及其總生物堿部位在體外對人腫瘤細胞株A549、BGC-823、K562均具有一定的細胞毒活性。此8個化合物均無明顯細胞毒活性，進一步活性測試和化學研究尚在進行中。

孔雀柏；化學成分；細胞毒活性

孔雀柏(Chamaecyparisobtusacv.Tetragon)是扁柏屬植物日本扁柏的一個栽培變種，主要分布于北美、日本及我國臺灣，我國有1種及其1變種[1]。該屬植物有涼血、止血之功效，用于治療吐血、鼻衄、便血、尿血、慢性氣管炎、失眠及便秘等證，具有廣闊的藥用價值[2]。其含有的化合物大多結構新穎，生物活性多樣，很多具有抗腫瘤和抗病毒等活性[3-5]。有關孔雀柏的化學及活性成分的研究獻報道較少，目前僅有本研究組前期從中分離得到一個新骨架的二萜生物堿chamobtusin A[6]。為進一步尋找孔雀柏中的抗腫瘤活性成分，筆者對孔雀柏的枝葉進行了較深入的化學與抗腫瘤細胞毒活性研究。首次從其甲醇提取物中分離鑒定出8個化合物，體外活性篩選表明其對人腫瘤細胞株A549、BGC-823和K562上尚無明顯細胞毒活性。

1 儀器與材料

MS采用液相離子阱色譜質譜聯(lián)用儀Bruker HCT/ESQUIRE測定；NMR采用BrukerAM-400和Bruker DRX-500超導核磁共振儀測定；分離純化采用安捷倫1100、島津LC-20A高效液相色譜儀；Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia公司)；硅膠(青島化工廠)；RP-C18柱色譜材料(Merck公司)；TLC硅膠H預制薄層板(青島工廠)，顯色方法為254、365nm熒光，10%硫酸乙醇溶液顯色。

孔雀柏枝葉2013年5月采集于云南昆明，原植物經中國科學院昆明植物研究所孫衛(wèi)邦研究員鑒定為孔雀柏Chamaecyparisobtusacv.Tetragon。

2 提取與分離

取孔雀柏干燥枝葉22kg，粉碎后用工業(yè)甲醇冷浸提取3次，減壓回收甲醇得1.45kg總浸膏?？偨嘤脽崴稚⒑?，以稀HCl酸化(pH2.0)，用乙酸乙酯萃取四次，得乙酸乙酯浸膏630g。所得水部分用NaOH堿化(pH10.0)，用氯仿萃取4次，回收氯仿得到總堿部分12.5g。剩余水部分用稀HCl調節(jié)pH7.0，再分別以氯仿和正丁醇萃取，得到正丁醇部位浸膏456g。乙酸乙酯部位經硅膠色譜分離，用石油醚-丙酮(10∶1→0∶1)系統(tǒng)梯度洗脫, 得6個流分(Fr.7～12)。Fr.8經反復硅膠色譜(石油醚-乙酸乙酯8∶1→ 2∶1)、凝膠色譜(LH-20、氯仿-甲醇1∶1)分離純化得到化合物5(13mg)和化合物7(18 mg)。Fr.11經反復硅膠色譜(石油醚-乙酸乙酯8∶1→2∶1)、凝膠色譜(LH-20, 氯仿-甲醇1∶1)分離純化得到化合物4(15mg) 、化合物6(17mg)、化合物1(30mg)。正丁醇部位經硅膠色譜用氯仿-甲醇(9∶1→1∶1) 系統(tǒng)梯度洗脫，得6個流分(Fr.1～6)。Fr.1和Fr.3經反復凝膠色譜(LH-20、氯仿-甲醇1∶1)、RP-C18(甲醇-水0∶100→30∶70)、HPLC(甲醇-水5∶95→20∶80)分離得到化合物8(16mg)、化合物2(15mg)、化合物3(56mg) 和化合物7(20mg)。

3 結構鑒定

化合物1：黃色針狀結晶，分子式C15H14O6，ESI-MSm/z:289[M-H]-。1H-NMR(CD3OD,500MHz):δ4.56(1H,d,J=7.6Hz,H-2),3.99(1H,m,H-3),2.83(1H,d,J=9.1Hz,Ha-4),2.59(1H,d,J=9.1Hz,Hb-4),2.59(1H,d,J=9.1Hz,H-4),5.93(1H,d,J=2.2 Hz,H-6),5.85(1H,d,J=2.2Hz,H-8),6.83(1H,d,J=1.8Hz,H-2′),6.76(1H,d,J=8.3Hz,H-5′),6.70(1H,d,J=8.3Hz,H-6′)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)：δ82.8(C-2)，68.7(C-3),28.5(C-4)，157.5(C-5)，96.4(C-6)，156.8(C-7)，95.6(C-8)，157.7(C-9)，100.9(C-10)，132.2(C-1′)，115.3(C-2′)，146.2(C-3′)，146.2(C-4′),115.3(C-5′)，120.1(C-6′)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[7]比較, 鑒定化合物1為catechin。

化合物2：黃色結晶，分子式C20H20O11，EI+-MSm/z:435[M-H]-。1H-NMR(CD3OD,400MHz):δ5.06(1H,d,J=10.0Hz,H-2),4.73(1H,d,J=10.0Hz,H-3),5.88(1H,d,J=2.0Hz,H-6),5.89(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.95(1H,d,J=1.8Hz,H-2′),6.80(1H,d,J=1.8Hz,H-5′),6.80(1H,d,J=1.8Hz,H-6′),3.82(1H,d,J=6.1Hz,H-1)13C-NMR(CD3OD,100MHz):δ83.6(C-2),77.4(C-3),195.7(C-4),165.4(C-5),96.4(C-6),168.9(C-7),97.4(C-8),164.1(C-9),102.4(C-10),129.0(C-1′)，115.3(C-2′)，146.2(C-3′)，146.2(C-4′),116.2(C-5′)，120.9(C-6′),103.1(C-1〞),73.4 (C-2〞),75.8(C-3〞)，70.8(C-4〞),66.0(C-5〞)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[8]比較,鑒定化合物2為taxifolin-3-O-β-D-xylopyr-anosi-de。

化合物3：白色粉末，分子式C26H34O10,EI+-MSm/z:506[M]+。1H-NMR(CD3OD,400MHz)：δ6.71(1H,s，H-2)，7.06(1H,s,H-6),2.60(2H,t,H-7),1.80(2H,m,H-8),3.55(2H,m,H-9),7.01(1H,d,J=1.8Hz,H-2′),7.09(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′)，6.89(1H,dd,J=8.5,1.8Hz,H-6′),5.53(1H,d,J=6.0Hz,H-7′),3.44(1H,m,H-8′),3.80(2H,m,H-9′)，5.33(1H,d,J=1.5Hz,H-1), 3.76(3H,s,3-OCH3),3.84(3H,s,3′-OCH3)；13C-NMR(CD3OD,100MHz):δ 137.1(C-1),114.0(C-2),145.2(C-3),147.4(C-4),129.6(C-5),117.9(C-6),32.9(C-7),35.8(C-8),65.2(C-9),138.8(C-1′),111.2(C-2′),152.1(C-3′),146.5(C-4′),119.6(C-5′),119.1(C-6′),88.6(C-7′),55.6(C-8′),65.1(C-9′),101.3(C-1〞),72.1(C-2〞),72.0(C-3〞),73.8(C-4〞),70.8(C-5〞),18.0(C-6〞),56.4(3-OCH3),56.7(3′-OCH3)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[9]比較,鑒定化合物3為icariside E4。

化合物4：無色油狀，分子式C21H24O6,ESI-MSm/z:371[M-H]-。其1H-NMR和13C-NMR圖譜與本實驗室對照品(-)arctigenin圖譜一致，TLC上的斑點位置及顯色與(-)arctigenin標準品相同。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[10]比較, 鑒定化合物4為(-)arctigenin。

化合物5：白色結晶，分子式C20H16O6，EI+-MSm/z:352[M]+。其1H-NMR和13C-NMR圖譜與本實驗室對照品savinin圖譜一致，TLC上的斑點位置及顯色與savinin標準品相同。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[10]比較, 鑒定化合物5為savinin。

化合物6：白色針狀結晶，分子式C20H20O6，EI+-MSm/z: 356[M]+,。其1H-NMR和13C-NMR圖譜與本實驗室對照品horsfieldin圖譜一致，TLC上的斑點位置及顯色與horsfieldin標準品相同。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[10]比較, 鑒定化合物6為 horsfieldin。

化合物7：無色結晶，分子式C20H20O6，ESI-MSm/z:339[M-OH]-。其1H-NMR和13C-NMR圖譜與本實驗室對照品dihydrosesamin圖譜一致，TLC上的斑點位置及顯色與dihydrosesamin標準品相同。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻比較[10], 鑒定化合物7為dihydrosesamin。

化合物8：白色粉末，分子式C20H16O6，其1H-NMR和13C-NMR圖譜與本實驗室對照品skimmin圖譜一致，TLC上的斑點位置及顯色與skimmin標準品相同。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻[11]比較, 鑒定化合物8為skimmin。

4 結論

本研究從采自云南昆明的孔雀柏中首次分離鑒定了catechin(1)、taxifolin-3-O-β-D-xylopyranoside(2)、icariside E4(3)、(-)arctigenin(4)、savinin(5)、horsfieldin(6)、dihydrosesamin(7)和skimmin (8)等8個化合物。體外活性測試結果顯示，孔雀柏甲醇總提物在A549、BGC-823、K562腫瘤細胞株上均具有一定細胞毒活性( IC50=2.47，3.88，32.48μg/mL), 孔雀柏總生物堿部分在K562腫瘤細胞株上具有一定細胞毒活性( IC50=5.29μg/mL)。本文中所分離得到的8個單體化合物對A549、BGC-823和K562腫瘤細胞株均無明顯細胞毒活性，提示該植物中可能還有其他細胞毒活性小分子化合物，為其活性成分的進一步開發(fā)研究及臨床應用奠定了試驗基礎。

[1] 鄭萬鈞,傅立國.中國植物志[M].第7卷.北京:科學出版社,1978:344.

[2] RUI TIAN.Studies on Chemical Constituents of Chamaecyp obtusa [D].濟南:山東大學，2011.

[3] LIU R,ZHOU C,OU YANG M.Progress in chemical constituents of Chamaecyparis obtusevar. Formosana [J]. Nat Prod Res Dev,2006(18):187.

[4] HSIEH CC,KUO YH,KUO CC,et al. Chamaecypanone C，a novel skeleton microtubule inhibitor, with anticancer activity by trigger caspase 8-Fas/FasL dependent apoptotic pathway in human cancer cells [J]. Biochem Pharmacol, 2010(79): 1261.

[5] JIANG JH,LI XC,GAO TH,et al. Volatile constituents from the cupressaceae plants and their antitumor activities [J]. Fujian Forest Sci Technol, 2006(33): 524.

[6] ZHANG YM,TAN NH，LU Y，et al. Chamobtusin A, a Novel skeleton diterpenoid alkaloid[J]. Organic Letters, 2007, 9(22): 4579.

[7] ADRIENNE LD,YA CA,DAVIES AP, et al. 1H and 13C-NMR Assignments ofsome green tea polyphenols [J]. Magnetic Resonance in Chemistry, 1996(34): 887.

[8] ZEECK A,DUBELER A,VOLTMER G,et al. Phenols from Fagus Sylvatica and their role in defence against cryptococcus fagisuga [J]. Phytochemistry, 1997(45):51.

[9] KOUNO I,HASHIMOTO M,ENJOJI S,et al. Isolation of Neoanisatin derivatives from the pericarps of Illicium majus with other constituents[J].Chem.Pharm Bull, 1991, 39(7): 1773.

[10] XU J,ZHANG YM,TAN NH,et al.A New Lignan Glycoside from Chamaecyparis obtusa var. breviramea f. crippsii [J]. Natural Product Communications,2014，9(2):215.

[11] XU J,ZHANG YM,TAN NH, et al. A new monoterpenoid glucoside from the twigs of Chamaecyparis obtusa var. breviramea f. Crippsii [J]. Acta Pharmaceutica Sinica,2012, 47 (9): 1179.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-02-26

蔡旭，湖北中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為中藥資源與中藥復方。

張玉梅，博士，中國科學院西雙版納熱帶植物園副研究員，研究方向為民族藥。

R284.1

A

1673-2197(2015)12-0029-02

10.11954/ytctyy.201512012