魏國麗 周 宇

漢黃芩素對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響※

魏國麗 周 宇

目的 探討漢黃芩素對體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖及STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法 取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，經(jīng)30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L和120 μmol/L不同濃度的漢黃芩素處理24 h和48 h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法測定不同時(shí)間和不同濃度漢黃芩素對HT-29細(xì)胞增殖的影響；不同濃度漢黃芩素作用HT-29細(xì)胞48 h后，采用RT-PCR方法檢測STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中髓樣細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）、抗凋亡蛋白（Bcl-xl）和原癌基因信使RNA（c-Myc mRNA）表達(dá)水平。結(jié)果 漢黃芩素抑制HT-29細(xì)胞增殖，且隨作用時(shí)間、濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升；經(jīng)不同濃度漢黃芩素處理HT-29細(xì)胞48 h后，Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，各濃度漢黃芩素組與空白對照組及組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 漢黃芩素體外可呈時(shí)間-濃度依賴性抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，這可能與下調(diào)STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Mcl-1、Bcl-xl、c-Myc mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

漢黃芩素；HT-29細(xì)胞；細(xì)胞增殖；STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

漢黃芩素（wogonin）是中草藥黃芩中提取的一種具有抗腫瘤與免疫增強(qiáng)、抗病毒、抗氧化、降血脂等廣泛生物學(xué)活性[1]的天然黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)異常密切相關(guān)，然而漢黃芩素對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及 STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否有影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在探討漢黃芩素對結(jié)腸癌細(xì)胞作用的可能機(jī)制，為漢黃芩素的抗癌作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 漢黃芩素純度＞99%，購自上海友思生物技術(shù)有限公司；另外自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室采購人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)材料；實(shí)驗(yàn)用的RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物制品公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自武漢博士德生物工程有

限公司；胰蛋白酶（trypsin）、二甲亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物技術(shù)有限公司，PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的孵育箱中飽和濕度下培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長，待細(xì)胞生長接近80%時(shí)，收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 以每孔1×104/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板上，200 μl/孔。待細(xì)胞貼壁后，漢黃芩素組分別加入不同濃度漢黃芩素（30、60、90、120 μmol/L），空白對照組加無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（不含聚酰胺）。作用24、48 h后棄上清，加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液180 μl，同時(shí)每孔加入MTT（5g/L）20 μl，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心，棄孔內(nèi)上清液后，加入DMSO 150 μl 振蕩10 min，使沉淀充分溶解；用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的吸光度（A）值，記錄結(jié)果。計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率＝（空白對照組吸光度－漢黃芩素組吸光值）/空白對照組吸光度×100%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 RT-PCR法檢測髓樣細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）、抗凋亡蛋白（Bcl-xl）和原癌基因信使RNA（c-Myc mRNA）表達(dá)水平常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞接種于 6孔板，密度為 2×105個(gè)細(xì)胞/孔。依照漢黃芩素濃度（30、60、90、120 μmol/L）分為4組，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，鑒定cDNA模板的完整性，分光光度法測定計(jì)算總RNA含量及濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系20 μl，其中SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0 μl，上、下游引物各0.4 μl（10 μmol/L），cDNA 2.0 μl，蒸餾水H2O 7.2μl。反應(yīng)條件如下，95℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 5 m，40個(gè)循環(huán)。采用2－△△Ct相對定量法比較各組mRNA相對表達(dá)量。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫查找基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 漢黃芩素處理后HT-29細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測相關(guān)基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對細(xì)胞增殖的影響 各濃度漢黃芩素組與空白對照組及組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），隨著漢黃芩素作用時(shí)間延長、濃度逐漸增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升，見表2。

表2 漢黃芩素對HT-29細(xì)胞增殖的影響

2.2 漢黃芩素對Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc的mRNA表達(dá)影響 經(jīng)不同濃度漢黃芩素處理 48 h后，Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，漢黃芩素對Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc mRNA表達(dá)均有抑制作用，各濃度漢黃芩素組與空白對照組及組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 漢黃芩素對Mcl-1、Bcl-xl、c-Myc mRNA表達(dá)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素對胃癌等多種腫瘤細(xì)胞株的增殖有明顯的抑制作用，且作為增敏劑可協(xié)同化療藥物增強(qiáng)抗癌活性[2]。也有研究認(rèn)為，漢黃芩素可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表型，阻滯細(xì)胞周期，抑制端粒酶活性和抑制血管生成等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬與凋亡。另外，漢黃芩素還可以通過上調(diào)胞內(nèi)ROS水平及p53信號，調(diào)節(jié)MAPKs分子，抑制核因子-κB活性等途徑，影響多種信號通路，其抗腫瘤作用機(jī)制與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[3]。

STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)，其重要轉(zhuǎn)錄因子STAT3是存在于細(xì)胞質(zhì)與酪氨

酸磷酸化信號通道偶聯(lián)的雙功能蛋白，具有致癌潛能，其過度激活將導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖與凋亡障礙，且其表達(dá)和活化與胃腸道腫瘤密切相關(guān)[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用漢黃芩素干預(yù)結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞24 h和48 h后，不同時(shí)間各濃度漢黃芩素組細(xì)胞增殖抑制率比空白對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明漢黃芩素可能有抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖作用。研究還發(fā)現(xiàn)，增加漢黃芩素的作用濃度，其對HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯，呈濃度依賴性，這為臨床應(yīng)用漢黃芩素治療結(jié)腸癌的最佳劑量篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度漢黃芩素干預(yù)HT-29細(xì)胞 48 h后，各濃度漢黃芩素組 Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc基因mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，分別與空白對照組及組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明漢黃芩素可能通過降低Mcl-1、Bcl-xl和c-Myc諸基因表達(dá)水平而發(fā)揮對結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞的抑制作用，STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性增高可能與結(jié)腸癌密切相關(guān)。STAT3靶基因產(chǎn)物包括影響細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族成員，Mcl-1、Bcl-xl均為Bcl-2凋亡家族成員中主要的抑凋亡分子，在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，抗凋亡基因Mcl-1具有抑制凋亡、維持細(xì)胞生存作用，但目前在結(jié)腸癌方面研究較少[5]。抑制凋亡蛋白Bcl-xl在癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可反映結(jié)腸癌的惡性程度，作為結(jié)腸癌基因治療的靶點(diǎn)[6]。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子 c-Myc是STAT3分子的下游靶基因，在腫瘤組織中明顯高表達(dá)，c-Myc的失活可作為腫瘤細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[7]。本研究結(jié)果表明，漢黃芩素可下調(diào)Mcl-1、Bcl-xl和 c-Myc表達(dá)水平，抑制 HT-29細(xì)胞增殖，為STAT3通路與腫瘤分子靶向治療的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Wogonin on Proliferation and STAT3 signal Transduction Pathway in Human colon Carcinoma Cell line HT-29

Wei Guoli Zhou Yu

Objective The study is to explore the effects of wogonin on proliferation and STAT3 signal transduction pathway in human colon carcinoma cell line HT-29.Methods Human colon carcinoma cell line HT-29 of logarithm vegetal period were cultured with different density of wogonin(30,60,90,120μmol/L) for 24 hours and 48 hours,the effects of diverse density of wogonin on HT-29 cell proliferation was assayed separately by MTT method at different time;and after 48 hours of different concentration wogonin action,the expression of Mcl-1,Bcl-xl and c-Myc mRNA was measured by fluorescent quantitative PCR respectively.Results Wogonin restrained the HT-29 cell proliferation, What’s more,with the increase of wogonin action time and concentration,the suppression rate of cell proliferation was gradually rising up.Intervened by the different concentration wogonin in HT-29 cell for 48 h,the expression of Mcl-1, Bcl-xl and c-Myc mRNA in every wogonin groups was reduced significantly.What’s more,there was statistical difference among the wogonin groups and the control group(P＜0.05).Conclusion Wogonin could inhibit the proliferation of HT-29 cells in a time and density-dependent manner,and it could possibly contribute to reduce Mcl-1,Bcl-xl and c-Myc mRNA expression levels in STAT3 signal transduction pathway.

Wogonin;HT-29;Proliferation;STAT3 signal transduction pathway

R735.3+4

A

1673-5846(2015)06-0032-03

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東湛江 52400

2014年湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2014B01081）

作者信息：魏國麗（1978.10-），研究生，副教授。主要從事消化內(nèi)科學(xué)方向的研究