陳霞，梅欣明，徐瑲，趙宏賢

（1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，四川 瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學組織胚胎教研室，四川 瀘州 646000）

·論著·

內質網(wǎng)應激介導的糖尿病大鼠胃平滑肌凋亡及大黃素干預作用*

陳霞1，梅欣明2，徐瑲2，趙宏賢2

（1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，四川 瀘州 646000；2.四川醫(yī)科大學組織胚胎教研室，四川 瀘州 646000）

目的探討糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡機制及大黃素干預機制。方法SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病組及大黃素組。造模10周時檢測胃排空；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測胃平滑肌細胞凋亡；免疫組織化學檢測胃平滑肌細胞葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）、Caspase-12蛋白表達。結果①與對照組比較，糖尿病組大鼠胃內色素殘留率顯著增高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，大黃素組胃內色素殘留率顯著下降（P＜0.05）。②糖尿病組大鼠較對照組的胃平滑肌細胞凋亡、GRP78及Caspase-12蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；與糖尿病組比較，大黃素組大鼠胃平滑肌細胞凋亡、GRP78及Caspase-12蛋白表達顯著降低。結論內質網(wǎng)應激（ERS）途徑可能介導糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡。大黃素可能通過減少ERS介導的胃平滑肌細胞凋亡，改善糖尿病大鼠胃排空功能。

大黃素；糖尿病胃輕癱；胃平滑??；凋亡；內質網(wǎng)應激

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以胃排空延遲為主要特點的癥候群，臨床表現(xiàn)為早飽、腹脹、惡心、嘔吐等癥狀。有資料顯示，50%～76%的糖尿病患者存在胃排空異常[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，DGP大鼠胃平滑肌凋亡增加[2]。內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress response，ERS）作為十分重要的第3條細胞凋亡途徑，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。但是ERS是否介導糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡，尚未見相關報道。大黃素是中藥大黃主要活性成份，現(xiàn)代研究證實大黃素能夠明顯調節(jié)胃腸道平滑肌運動[3-7]，但具體機制有待深入研究。本實驗建立糖尿病大鼠模型，檢測ERS是否參與糖尿病胃平滑肌細胞凋亡，以及大黃素對其干預作用，為DGP臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

清潔級雄性SD大鼠30只，6～8周，體重約200 g，由瀘州醫(yī)學院動物科提供，許可證號：川實動管質第17號。

1.2儀器與試劑

J02005型722分光光度計（廈門分析儀器廠），One Touch Horion血糖儀（深圳強生醫(yī)療器材有限公司），鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），大黃素（純度為98%，上海晶純有限公司），脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒（瑞典Roche Diagnostics公司），葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、Caspase-12多克隆抗體（美國Bioword公司）。

1.3方法

1.3.1糖尿病造模SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周。血糖正常大鼠30只，其中隨機選取10只健康SD鼠作為對照組，其余大鼠鏈脲佐菌素（streptozotosin，STZ）65 mg/kg腹腔注射以復制糖尿病模型；對照組給予等量檸檬酸緩沖液。3 d后，禁食不禁水6 h，采尾血測空腹血糖，以血糖持續(xù)1周≥16.7 mmol/L為造模成功。糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組和大黃素組，每組10只。造模2周時，對照組與糖尿病組以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）5 ml/kg灌胃，大黃素組用8 g/L大黃素混懸液灌胃，5 ml/kg，1次/d，連續(xù)8周。①一般指標：檢測進食量、飲水量、尿量等，每周測體重1次。②血糖測定：STZ注射后第1、4、8和10周采尾血測空腹血糖。

1.3.2胃排空檢測第10周，各組大鼠禁食不禁水24 h后，將1 mg/ml美藍溶液0.4 ml經(jīng)口胃管灌入，30 min后處死大鼠，取全胃。將胃內殘留物用4 ml生理鹽水沖洗并收集沖洗液，低速離心機3 500 r/min離心15 min，取上清液，用722分光光度計在640 nm波長檢測吸光度值（optical density，OD）。大鼠胃排空用胃內色素的殘留率表示，胃內色素殘留率=測定管OD值/標準管OD值×100%。

1.3.3TUNEL法檢測胃平滑肌細胞凋亡按TUNEL試劑盒說明書步驟進行染色。切片放入3%雙氧水H2O2溶液中，室溫10 min。PBS洗滌樣片，將TdT及Biotin-dUTP混合液加至樣片，50μl/片，陰性對照只加Biotin-dUTP，50μl/片，加蓋玻片，37℃濕盒中孵育標記60 min。以封閉液按照1∶50配置HRP為工作液，50μl加于樣品片，37℃盒中孵育標記60 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑顯色，蘇木素染液復染胞核。TUNEL法陽性結果判斷：細胞核棕黃（褐）色。每組取10個標本，每個標本1張切片，數(shù)碼顯微鏡照相，Image-proplus 5.0軟件計算各組細胞凋亡率。

1.3.4免疫組織化學檢測GRP78、Caspase12蛋白表達胃平滑肌組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗3 min×3次，微波抗原修復20min。正常羊血清封閉，室溫孵育15min，加1∶100一抗體4℃過夜，PBS洗片5 min×3次，滴加生物素標記二抗，37℃，20min，PBS洗片5 min× 3次，加鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidinbiotin complex，SABC）液，37℃，20 min，PBS洗片5 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察、照相。以PBS代替一抗作陰性對照組。GRP78與Caspase12陽性結果判斷：細胞質著色，染成棕黃（褐）色。每組取10個標本，每個標本連續(xù)切片2張，數(shù)碼顯微鏡照相，Image-proplus 5.0圖

像分析軟件分析蛋白陽性表達細胞。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1一般情況

對照組大鼠一般情況良好。糖尿病組和大黃素組大鼠造模后第3天開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿；成模10周時，兩組大鼠精神萎靡、反應遲鈍、皮毛疏松無光澤、背部毛發(fā)部分脫落、少數(shù)極度衰竭，體重顯著低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 10周時各組大鼠體重與血糖濃度比較（n=10±s）

表1 10周時各組大鼠體重與血糖濃度比較（n=10±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與糖尿病組比較，P＜0.05

組別體重/g血糖濃度/（mmol/L）對照組465.00±19.005.38±1.20糖尿病組172.50±29.561）28.63±4.501）大黃素組178.30±17.741）21.51±9.451）2）F值541.45738.477

2.2血糖濃度測定

造模3 d后，模型組和大黃素組空腹血糖始終維持＞16.7 mmol/L。成模10周時，與對照組比較，模型組和大黃素組大鼠血糖顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素組大鼠血糖顯著降低（P＜0.05），但未降至正常水平。見表1。

2.3胃內色素殘留率測定

糖尿病大鼠胃內美藍殘留率顯著高于對照組（F=85.366，P＜0.05）。與糖尿病組比較，大黃素組胃內美藍殘留率顯著降低（F=85.366，P＜0.05）。見表2。

表2 各組胃內色素殘留率與胃平滑肌細胞凋亡率比較（n=10，%±s）

表2 各組胃內色素殘留率與胃平滑肌細胞凋亡率比較（n=10，%±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與糖尿病組比較，P＜0.05

組別色素殘留率細胞凋亡率對照組38.68±1.772.54±1.30糖尿病組51.81±2.601）11.65±3.301）大黃素組42.89±2.461）2）6.50±1.971）2）F值85.36657.043

2.4胃平滑肌細胞凋亡率

糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡率顯著高于對照組（F=57.043，P＜0.05）。與糖尿病組比較，大黃素組胃平滑肌細胞凋亡率顯著降低（F=57.043，P＜0.05）。見圖1和表2。

圖1 各組胃平滑肌細胞凋亡（TUNEL×400）

2.5胃平滑肌細胞GRP78、Caspase12蛋白表達

與對照組比較，糖尿病大鼠胃平滑肌細胞GRP78 [（6.51±2.12）vs（20.21±3.56）]、Caspase12[（6.48± 2.11）vs（18.91±4.61）]蛋白陽性表達細胞顯著增多（F=47.809、35.910，P=0.000）。與糖尿病組比較，大黃素干預大鼠胃平滑肌細胞GRP78[（20.21±3.56）vs（12.04±3.55）]、Caspase12[（18.91±4.61）vs（12.92± 2.55）]蛋白陽性表達細胞顯著減少（F=47.809、35.910，P=0.000）。見圖2、3。

圖2 各組胃平滑肌細胞GRP78蛋白陽性表達（SABC×200）

圖3 各組胃平滑肌細胞Caspase12蛋白陽性表達（SABC×200）

3 討論

胃輕癱除導致上消化道癥狀外，還影響糖尿病患者的血糖控制。本實驗在造模10周的檢測結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠胃內色素殘留率增加，表明胃排空能力明顯減弱。DGP的發(fā)病機制尚未明確。近來大量研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可導致不同部位的細胞凋亡，胃腸平滑肌也不例外。本研究中TUNEL法檢測結果表明，糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡增多，與相關研究結果一致[2]。

近年來研究結果證明，內質網(wǎng)在把控細胞命運中發(fā)揮重要作用。感染因素、環(huán)境因素、不利的代謝條件等都可以干擾內質網(wǎng)的功能，破壞內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，達到一定程度便會產生ERS。GRP78是ERS的一種標志蛋白，GRP78的表達常提示ERS的存在，其在維持內質網(wǎng)蛋白質合成、正確折疊及細胞鈣穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[8]。本實驗結果顯示，GRP78蛋白在糖尿病大鼠胃平滑肌細胞中表達明顯增高，提示糖尿病大鼠胃平滑肌細胞存在ERS。

本實驗進一步探討糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡與ERS的相關性。在ERS介導的凋亡途徑中，Caspase-12起至關重要作用。Caspase-12以酶原形式存在于內質網(wǎng)膜胞漿側，是特異性ERS誘導細胞凋亡的重要調節(jié)子，在ERS時可特異性激活，非ERS介導的凋亡無Caspase-12活化[9]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠胃平滑肌細胞Caspase-12蛋白表達增強，Caspase-12相關的凋亡往往與ERS途徑有關。提示ERS途徑在糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡中起一定作用。糖尿病大鼠體內存在多種可誘發(fā)ERS的因素，如氧化應激和脂質代謝障礙。筆者推測，糖尿病患者由于多種不利因素導致ERS，促進細胞凋亡重要調節(jié)因子——Caspase-12的表達，誘導細胞凋亡，引起胃排空功能減低。

除此之外，本研究顯示，應用大黃素的大鼠胃排空能力明顯提高。大量動物實驗證實大黃素能夠明顯調節(jié)胃腸道平滑肌運動。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過離子通道、起搏細胞、神經(jīng)遞質、胃腸激素與炎癥反應的環(huán)節(jié)調節(jié)胃腸道平滑肌的收縮與舒張。但未見從平滑肌細胞凋亡角度，探討大黃素對胃腸運動影響的相關報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大黃素干預組大鼠胃平滑肌細胞凋亡及Caspase-12蛋白表達較糖尿病組降低，提示大黃素有可能通過調節(jié)ERS途徑，減少胃平滑肌細胞凋亡，改善糖尿病大鼠胃平滑肌的生理功能，從而改善胃排空能力。

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（張蕾 編輯）

Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis in gastric smooth muscle cells in diabetic rats and effects of Emodin intervention*

Xia CHEN1,Xin-ming MEI2,Qiang XU2,Hong-xian ZHAO2
(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital,Luzhou Medical College,Luzhou, Sichuan 646000,P.R.China;2.Department of Histology and Embryology,Sichuan Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To investigate the mechanism of apoptosis of gastric smooth muscle cells(SMCs) in diabetic rats,and the mechanism involving the effect of Emodin on SMCs in diabetic rats.【Methods】SD rats were randomly divided into control group,diabetic group and Emodin group.Gastric emptying was determined in the 10th week.Apoptosis of gastric SMCs was detected by TUNEL method.Expressions of glucoseregulated protein 78(GRP78)and Caspase-12 protein were detected by immunohistochemistry.【Results】①The rate of gastric residual pigment was significantly increased in the diabetic group than in the control rats (P＜0.05).Compared with the diabetic group,the rate of gastric residual pigment was significantly decreased in the Emodin group(P＜0.05).②The cell apoptosis and the expressions of GRP78 and Caspase-12 protein in gastric smooth muscle cells were obviously increased in the diabetic group than in the control group(P＜0.05).Compared with the diabetic group,the cell apoptosis and the expressions of GRP78 and Caspase-12 protein in gastric smooth muscle cells were declined obviously in the Emodin group(P＜0.05).【Conclusions】Emodin can improve the gastric emptying,which may be involved with the reduction of apoptosis of gastric

Emodin;gastroparesis;gastric smooth muscle;apoptosis;endoplasmic reticulum stress

R587.1；R-332

A

1005-8982（2015）27-0018-04

2015-02-17

四川省瀘州市科技局重點項目[No：2009-S-15（5/7）]；四川省衛(wèi)生廳資助項目（No：100242）

趙宏賢，E-mail：zilong5276@sohu.com

SMCs in diabetic rats induced by endoplasmic reticulum(ER)stress pathway.