李偉麗，趙 超，車建途，李東樂，易武華，趙麗娟

（1.北京威力格生物科技有限公司，北京 102200；2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司，山西 清徐 030400）

腐敗醋中微生物的分離鑒定及乳酸鏈球菌素對其抑制作用

李偉麗1,2，趙 超1,2，車建途1,2，李東樂1,2，易武華2，趙麗娟2

（1.北京威力格生物科技有限公司，北京 102200；2.山西水塔醋業(yè)股份有限公司，山西 清徐 030400）

從腐敗醋中分離出84 株不同微生物菌株，通過對其形態(tài)學觀察、革蘭氏染色、16S rDNA測序，并與GenBank中已知序列進行比對，以及進一步測定16S～23S ITS，發(fā)現(xiàn)其由20 株解淀粉芽孢桿菌、12 株地衣芽孢桿菌、6 株芽孢桿菌屬1NLA3E、12 株蠟樣芽孢桿菌、4 株巨大芽孢桿菌、3 株短短芽孢桿菌、2 株短小芽孢桿菌、11 株凝結(jié)芽孢桿菌、12 株類芽孢桿菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株產(chǎn)氣莢膜梭菌組成。除耐酸乳酸菌外，均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。通過管碟法和比濁法測定了乳酸鏈球菌素（Nisin）對以上菌株的抑菌效價，顯示Nisin對腐敗醋中分離得到的微生物菌株均具有明顯的抑菌或殺菌活性。

腐敗醋；16S rDNA；16S～23S ITS；分離鑒定；乳酸鏈球菌素

在食用醋的生產(chǎn)、陳釀、貯存過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)食醋風味變差甚至腐敗產(chǎn)生臭味的現(xiàn)象。在食用醋生產(chǎn)企業(yè)，夏季這種情況的產(chǎn)生尤為突出，其原因可能與夏季溫度較高，適宜微生物生長繁殖有關(guān)[1-4]。盡 管在食醋的生產(chǎn)過程中添加了對大部分細菌和真菌有較強抑制作用的苯甲酸鈉等作為化學防腐劑，但本研究通過對腐敗醋離心收集菌體、多次洗滌去除雜質(zhì)沉淀，鏡檢等操作后發(fā)現(xiàn)腐敗醋中依然存在大量可能導致食醋腐敗的桿狀細菌。

乳酸鏈球菌素（Nisin），又稱乳酸鏈球菌肽或乳鏈菌肽，是由乳酸鏈球菌經(jīng)特定發(fā)酵所產(chǎn)生的多肽類抗菌物質(zhì)，能有效地抑制容易引起食品腐敗變質(zhì)的大多數(shù)革蘭氏陽性菌（G+）[5-12]。Nisin的抑菌作用取決于其由34 個氨基酸組成小肽所具有的兩親性和所攜帶的正電荷，它們作用在細菌細胞壁所帶負電荷的陰離子成分上，形成孔狀結(jié)構(gòu)，引起細胞膜滲漏，導致小分子質(zhì)量的細胞成分如鉀離子、氫離子、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)從胞內(nèi)流出，引起細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌菌液中加入Nisin，會導致菌體變形，質(zhì)壁分離，進而菌體細胞破裂為殘片[10]。Nisin是一種純天然食品防腐劑。目前，我國已批準Nisin作為一種純天然食品防腐劑廣泛用于乳制品、發(fā)酵飲品、罐藏食品、肉類及肉制品的防腐保鮮[5-12]。Nisin有望在食醋生產(chǎn)中Nisin取代廣泛應(yīng)用的化學防腐劑，從而減少化學防腐劑對人體的損害。

為考察導致腐敗醋產(chǎn)生的微生物種類及Nisin對這些微生物的抑制作用，本研究按照國標中規(guī)定的分離細菌的方法，從腐敗醋中分離、培養(yǎng)微生物菌株，并對其進行形態(tài)學觀察，革蘭氏染色等實驗，進而測定其16S rDNA和16S～23S ITS序列，從分子水平上對這些菌株進行分類學鑒定。同時測定了Nisin對分離得到的腐敗醋污染菌株的抑菌活性，旨在為利用有效無毒的抑菌劑防治食醋腐敗提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

腐敗醋由山西水塔醋業(yè)股份有限公司提供。

PCA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、效價檢測培養(yǎng)基 北京博奧星生物技術(shù)有限責任公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker 北京康為世紀生物科技有限公司；溶菌酶溶液、細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；乳酸鏈球菌素 浙江新銀象公司；其他試劑均購自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、搖床、分光光度計、熒光顯微鏡 重慶奧特光學公司；GeneAmp PCR System 2720（ABI）、厭氧培養(yǎng)袋、厭氧產(chǎn)氣袋、氧氣指示劑 北京陸橋技術(shù)有限責任公司；ChampGel凝膠成像分析系統(tǒng) 北京賽智公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和試劑配制

效價檢測培養(yǎng)基：蛋白胨8 g、酵母浸粉3 g、葡萄糖5 g、Na2HPO4·12H2O 2 g、氯化鈉5 g、吐溫-20 5 mL，調(diào)節(jié)pH 6.8，瓊脂粉15 g，115 ℃滅菌15 min備用。

用0.02 mol/L無菌稀鹽酸配制Nisin濃度為103U/mL的標準液，室溫放置1 h，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ú怀^7 d），需要時用0.02 mol/L無菌鹽酸溶液配制1 000、100、50、25、10、0 U/mL 6 種效價的溶液，分別標記為5、4、3、2、1、0。

1.3.2 腐敗醋中微生物的鏡檢

取腐敗醋60 mL到100 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄去上清收集沉淀；然后用60 mL無菌生理鹽水重新懸浮沉淀，8 000 r/min離心5 min，棄去上清收集沉淀；重復(fù)用無菌生理鹽水洗滌沉淀4～5 次，最后沉淀用2 mL無菌生理鹽水懸浮。取20 μL菌液，按照GB/T 4789.28—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 染色法、培養(yǎng)基和試劑》的方法用結(jié)晶紫染液進行染色和鏡檢。

1.3.3 腐敗醋中微生物的分離和鑒定

分離方法：以下操作在超凈工作臺中進行。依據(jù)GB/T 4789.22—2003用25%滅菌碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)腐敗醋pH值至中性（pH 7.0），分別取100 μL，涂PCA平板、MC平板、MRS平板，各涂10 個平板。PCA平板和MC平板倒置平放于37 ℃生化培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)，觀察菌落情況。MRS平板于37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落情況。

挑取、轉(zhuǎn)接單菌落：PCA平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NB液體培養(yǎng)基，MC平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到MC液體培養(yǎng)基后過夜培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min，16～18 h），按照GB/T 4789.28—2003對菌液進行革蘭氏染色和鏡檢。MRS平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基，放置到圓底立式培養(yǎng)袋，袋中加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋、氧氣指示劑，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。按照GB/T 4789.28—2003對菌液進行革蘭氏染色和鏡檢。

1.3.4 腐敗醋中菌株基因組DNA的提取

取菌液2 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體，按試劑盒的方法提取基因組DNA。提取后的基因組DNA作為擴增16S rDNA和16S～23S ITS的模板。

1.3.5 16S rDNA序列擴增

利用通用引物27F和1492R以菌株總DNA為模版進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。在50 μL PCR反應(yīng)體系中加入38 μL水、5 μL Buffer、4 μL dNTP、引物27F和1492R各l μL、0.5 μL模版、0.5 μL Taq DNA聚合酶。擴增程序：95 ℃變性5 min后，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為序列測定的模板，送北京市理化分析測試中心進行測序。

1.3.6 16S～23S ITS序列擴增

利用通用引物L16S1349F和L523SR，以菌株總DNA為模版進行PCR[13-14]。在50 μL PCR反應(yīng)體系中加入38 μL水、5 μL Buffer、4 μL dNTP、正向引物L16S1349F和反向引物L523SR各1 μL、0.5 μL 模版、0.5 μL Taq DNA聚合酶。擴增程序：95 ℃變性5 min后，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后作為序列測定的模板，送北京市理化分析測試中心進行測序。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

將測序結(jié)果輸入數(shù)據(jù)庫http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析。根據(jù)比對結(jié)果，找出與數(shù)據(jù)庫同源性最高的已知菌種，推測待定菌株可能的屬或種。

1.3.8 管碟法檢測Nisin抑菌活性

Nisin對從PCA平板和MC平板分離得到的好氧和兼性厭氧微生物菌株進行抑菌活性測定：將效價檢測固體培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入適量菌懸液使培養(yǎng)基中菌液濃度達到5×105～5×106CFU/mL，混勻后倒入平板；平板放置水平臺面冷卻后，在平皿中均勻放入牛津杯（直徑8.00 mm），靜置10 min使其自然下沉；取200 μL已制備好的Nisin溶液加入牛津杯中，平穩(wěn)移至恒溫箱，37 ℃培養(yǎng)16 h左右，移去牛津杯觀察抑菌圈大小，利用游標卡尺測量抑菌圈直徑d（mm），抑菌效果（X）計算公式為：

1.3.9 濁度法檢測Nisin抑菌活性

Nisin對經(jīng)MRS平板分離得到的兼性厭氧菌和厭氧菌的抑菌活性測定：將2.25 mL Nisin標準品溶液與1 mL菌懸液（OD600nm為1.0左右的指示菌溶液）加入含有15 mL MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中混勻；同時取2 個厭氧管分別加2.25 mL無菌稀鹽酸、1 mL指示菌混合液，再分別加入15 mL MRS液體培養(yǎng)基混勻，其中1 管作為同步培養(yǎng)時的陽性對照，另1 管用于測定初始培養(yǎng)時的OD600nm；用MRS液體培養(yǎng)基進行調(diào)零，37 ℃培養(yǎng)24～120 h、取樣，讀取OD600nm值并作相應(yīng)記錄。根據(jù)所得到的OD600nm值進行抑菌率（I）分析，計算公式如下：

式中：OD1、OD2、OD0分別代表陽性對照、待測樣品和初始培養(yǎng)的OD600nm值。抑菌活性實驗重復(fù)3 次，結(jié)果為。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗醋中微生物鏡檢

鏡檢發(fā)現(xiàn)，腐敗醋中含有包括長桿菌和短桿菌等形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯差異的多種桿狀細菌（圖1）。

圖1 腐敗醋中的微生物Fig.1 Microorganisms observed in spoiled vinegar

2.2 腐敗醋中分離獲得菌株的形態(tài)觀察和革蘭氏染色

對分離得到的菌株編號，進行菌落形態(tài)學觀察、革蘭氏染色和鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的菌株均呈桿狀形態(tài)的G+。

2.3 16S rDNA和16S～23S ITS測序

由表1、2可知，從腐敗醋中分離獲得84 株菌，其組成為20 株解淀粉芽孢桿菌、12 株地衣芽孢桿菌、6 株芽孢桿菌屬1NLA3E、12 株蠟樣芽孢桿菌、4 株巨大芽孢桿菌、3 株短短芽孢桿菌、2 株短小芽孢桿菌、11 株凝結(jié)芽孢桿菌、12 株類芽孢桿菌、1 株耐酸乳酸菌、1 株產(chǎn)氣莢膜梭菌。分離得到的菌株除一株耐酸乳酸菌外其余均為芽孢桿菌，均屬于G+。

表1 PCA培養(yǎng)基平板分離獲得的菌株Table 1 Bacterial strains separated from spoiled vinegar in PCA medium

表2 乳酸菌培養(yǎng)基平板分離獲得的菌株Table 2 Bacterial strains separated from spoiled vinegar in MCTable 2 Bact medium and MRS medium

2.4 指示菌的選取

根據(jù)測序比對結(jié)果，從PCA平板和MC平板分離獲得的菌株中選取112、204、105、2py01、104、301、212c、4py01、mc401分別作為解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、芽孢桿菌屬1NLA3E、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、類芽孢桿菌的指示菌。同樣在MRS平板分離得到的厭氧菌株中選取 mrs101、mrs102、mrs301、mrs305分別作為蠟樣芽孢桿菌、耐酸乳酸菌、凝結(jié)芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的指示菌。

2.5 管碟法檢測Nisin對指示菌的抑菌活性

由表3可知，Nisin對不同指示菌株均具有抑菌活性，其抑菌作用數(shù)值越大表示其抑菌效價越高。Nisin濃度為0時，有抑菌圈產(chǎn)生，說明稀鹽酸對菌株105、2py01、104也有抑制作用，添加Nisin后，抑菌作用增強。

表3 管碟法測定Nisin對指示菌的抑菌作用Table 3 Bactericidal effect of Nisin on indicator strains using Oxford plate assssaayy

2.6 濁度法檢測Nisin對指示菌的抑菌活性

根據(jù)測序比對結(jié)果從MRS平板分離獲得的厭氧菌株或兼性厭氧菌株中選取mrs101、mrs102、mrs103、mrs305作為蠟樣芽孢桿菌、耐酸乳酸菌、凝結(jié)芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的指示菌。通過濁度法檢測Nisin對其抑菌效價。

表4 濁度法測定乳酸鏈球菌素對指示菌的抑菌作用Table 4 Bactericidal effect of Nisin on indicator strains usingTable 4 Bacte turbidity method

由表4和公式（2）計算可知，菌液中添加Nisin后，其對MRS培養(yǎng)基分離得到的mrs101、mrs102、mrs301、mrs305這4株菌的抑菌率分別為105.0%、105.0%、104.5%、108.5%，表明Nisin對它們均有很強的殺菌效果。由于Nisin的殺菌作用導致指示菌死亡溶解，從而造成添加Nisin后培養(yǎng)一定時間的菌液OD600nm值小于初始培養(yǎng)菌液OD600nm值，故抑菌率大于100%。

3 討 論

本研究從腐敗醋中分離得到的菌株除一株耐酸乳酸菌外均為芽孢桿菌。其中解淀粉芽孢桿菌菌株最多，其16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、萎縮芽胞桿菌的相同序列同源性均為99%，為了進一步具體確定它們的歸屬，使用了正向引物L16S1349F和反向引物L523SR擴增其16S～23S ITS[14-19]。

解淀粉芽孢桿菌基因組（G e n B a n k 登錄號NC_009725.1）中的16S～23S ITS序列存在10 條等位基因片段，利用正向引物L16S1349F和反向引物L523SR可以擴增出2 條628 bp基因片段（僅有一個堿基不同），2 條512 bp基因片段（2 個堿基不同），6 條454 bp基因片段（5 條堿基序列一致，1 條有3 個堿基不同 ）?？莶菅挎邨U菌基因組（GenBank 登錄號NC_000964.3）中的16S～23S ITS序列存在10 條等位基因片段，利用正向引物L16S1349F和反向引物L523SR可以擴增出2 條序列完全一致的626 bp基因片段，8 條序列不完全一致的446 bp基因片段。萎縮芽孢桿菌基因組（GenBank登錄號NC_014639.1）中的16S～23S ITS序列存在7 條等位基因片段，利用正向引物L16S1349F和反向引物L523SR可以擴增出2條序列完全一致的632 bp的基因片段，5 條459 bp基因片段（4 條片段序列完全一致，另1 條多1 個堿基）。本實驗中利用正向引物L16S1349F和反向引物L523SR擴增出了3條基因片段，長度分別為628、512、454 bp，取長度為628 bp的片段測序后發(fā)現(xiàn)其序列與解淀粉芽孢桿菌的基因匹配。

王俊等[2]向固態(tài)發(fā)酵食用醋的無菌成品中直接添加分離得到的芽孢桿菌屬雜菌和葡糖桿菌屬雜菌，均引起了食用醋返混并產(chǎn)生酸臭味，均破壞了固態(tài)發(fā)酵食用醋成品的風味。本實驗則從腐敗醋中分離得到了一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，該菌適宜的生長溫度為37～47 ℃，在此溫度范圍內(nèi)其生長和繁殖速率極快，世代間隔時間僅為8 min，此外其能夠利用多種糖，代謝過程會產(chǎn)生H2S。推測此產(chǎn)氣莢膜梭菌污染食醋后可能會導致食醋風味發(fā)生變化，使其腐敗變臭。

Nisin對G+的抑菌效果明顯優(yōu)于對革蘭氏陰性細菌（G－）。G+和G－在結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)在細胞壁上。G+細胞壁肽聚糖含量豐富，交聯(lián)度高；而G－的細胞壁肽聚糖含量少，但組成復(fù)雜，主要包括磷脂、蛋白質(zhì)和脂多糖等，十分致密，僅允許分子質(zhì)量小于600 D的分子通過。Nisin的分子質(zhì)量約為3 500 D，無法正常通過G－細胞壁到達細胞膜。而Nisin對G+抑菌效果優(yōu)于對G－這一現(xiàn)象，從另一個側(cè)面證明了對細胞膜的吸附是Nisin發(fā)揮作用的必要條件[10]。

本實驗通過分離獲得的細菌均為G+，提示食醋的細菌污染主要來源于G+。抑菌實驗表明Nisin對從腐敗醋中分離得到的腐敗菌株均有明顯的抑菌或殺菌作用，與報道Nisin對G+具有抑菌或/和殺菌作用及機理的結(jié)果一致[5-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，管碟法檢測過程操作簡單，實驗結(jié)果直觀，培養(yǎng)過程中不需要添加厭氧袋，適用于好氧菌及兼性厭氧菌的培養(yǎng)，但對厭氧菌或兼性厭氧菌不適用。濁度法檢測過程中使用了厭氧管培養(yǎng)厭氧菌或兼性厭氧菌，方法對好氧菌或兼性好氧菌不適用。

楊榮杰[4]研究了苯甲酸鈉對芽孢桿菌的最小抑菌濃度，結(jié)果表明苯甲酸鈉的最低抑菌濃度已經(jīng)超出了其在食品中允許的最大添加量。由此可見，在食品安全允許范圍內(nèi)，苯甲酸鈉對芽孢桿菌的抑制作用有限。該報道同時也研究了Nisin對芽孢桿菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)其對芽孢桿菌的最小抑菌濃度遠小于其允許的最大添加量。本研究中，Nisin的抑菌濃度亦明顯低于食品中允許的最大添加量，提示在食品安全允許的范圍內(nèi)，添加Nisin能夠有效抑制芽孢桿菌的增殖生長[10]。由于食醋腐敗在食醋釀造行業(yè)幾乎每年夏天都會發(fā)生，對食醋釀造生產(chǎn)企業(yè)造成了很大經(jīng)濟損失。本研究為食醋生產(chǎn)過程中利用Nisin取代化學防腐劑預(yù)防腐敗醋的發(fā)生提供了一定的實驗依據(jù)。

本研究中分離到的微生物菌株并不一定都能夠引起食醋的腐敗，有關(guān)食醋腐敗的原因、條件、腐敗菌的組成等研究還有待進一步開展。構(gòu)建腐敗食醋中非培養(yǎng)微生物的克隆文庫[20-25]并開展食醋變質(zhì)過程中微生物菌群多態(tài)性分析，將會進一步為腐敗醋的防治工作提供有價值的指導。

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Inhibitory Effect of Nisin on Microorganisms Isolated and Identifi ed from Spoiled Vinegar

LI Weili1,2, ZHAO Chao1,2, CHE Jiantu1,2, LI Dongle1,2, YI Wuhua2, ZHAO Lijuan2
(1. Beijing S&V Science and Technology Co. Ltd., Beijing 102200, China; 2. Shanxi Shuita Vinegar Industry Co. Ltd., Qingxu 030400, China)

In the present study, 84 different bacterial strains were isolated from spoiled vinegar, which were identifi ed as 20 Bacillus amyloliquefaciens, 12 B. licheniformis, 6 Bacillus 1NLA3E, 12 Paenibacillus, 4 B. megaterium, 3 Brevibacillus brevis, 2 B. pumilus, 11 B. coagulans, 1 Lactobacillus acetotolerans and 1 Clostridium perfringens strains by morphological observation, 16S rDNA sequencing, and sequence alignment with GenBank database, as well as 16S-23S ITS sequencing. The inhibitory potency of nisin on these 84 bacterial strains was determined by assaying the diameter of inhibition zone using cup-plate method and turbidity using nephelometry, indicating that nisin had a signifi cant inhibitory activity on all the microbes isolated from the spoiled vinegar.

spoiled vinegar; 16S rDNA; 16S–23S ITS; isolation and identifi cation; Nisin

Q93

A

1002-6630（2015）01-0174-05

10.7506/spkx1002-6630-201501033

2014-03-11

李偉麗（1981—），女，中級工程師，碩士，研究方向為微生物學、分子生物學。E-mail：liweili524@sina.com