陳 琳，張 充，呂鳳霞，別小妹，趙海珍，陸兆新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成γ-氨基丁酸條件的優(yōu)化

陳 琳，張 充，呂鳳霞，別小妹，趙海珍，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

研究重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的適宜條件。檢測(cè)溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質(zhì)量比以及反應(yīng)體系體積對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：轉(zhuǎn)化體系5 mL、底物L(fēng)-谷氨酸鈉濃度0.1 mol/L、重組大腸桿菌細(xì)胞6.4 mg（干質(zhì)量）、Triton-100體積分?jǐn)?shù)0.06%、Ca2+濃度0.6 mmol/L，轉(zhuǎn)化溫度45 ℃、反應(yīng)體系pH 4.5。在該體系下反應(yīng)7 h，GABA合成量達(dá)到26.1 g/L，GABA轉(zhuǎn)化效率在1 h時(shí)達(dá)到最高，為13.8 g/（g?h），較優(yōu)化前提高1.5 倍。

γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；轉(zhuǎn)化條件；優(yōu)化

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA具有許多重要的生理功能，如降血壓[1]、預(yù)防癲癇[2]、抗抑郁[3]、抗疲勞[4]、控制哮喘[5]和促進(jìn)激素分泌等。由于GABA具有諸多重要的生理功能，已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子，正逐漸被廣泛應(yīng)用于食品保健、醫(yī)藥、化工及飼料[6]等領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)外都在積極研發(fā)富含GABA的食品，己成功研發(fā)的有茶飲料、米胚芽、功能性飲料、乳制品和大豆發(fā)酵制品[7-9]。

微生物法制備GABA的優(yōu)點(diǎn)很多，如安全性較高、反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)成本較低以及較好的商業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景等，因此，近年來(lái)微生物法制備GABA受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注，其中大腸桿菌、紅曲霉、釀酒酵母、乳酸菌等GABA生產(chǎn)菌種研究較為深入。已有很多研究證明乳酸菌具有合成GABA的能力[10-13]，乳酸菌作為一種有保健作用的益生菌，用其合成GABA越來(lái)越受到人們的青睞，目前用乳酸菌合成 GABA的研究主要集中在菌株的篩選、傳統(tǒng)誘變方法以及發(fā)酵條件優(yōu)化上，但是，由于乳酸菌具有發(fā)酵周期較長(zhǎng)以及培養(yǎng)條件較難控制等缺點(diǎn)，在生產(chǎn)強(qiáng)度上處于劣勢(shì)，而借助基因工程手段構(gòu)建高拷貝重組質(zhì)粒，導(dǎo)入宿主菌，可以使谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）表達(dá)量提高，獲得高GAD活性的基因工程菌，從而縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)強(qiáng)度。

GABA對(duì)紫外、可見(jiàn)光及電化學(xué)都不靈敏，直接檢測(cè)GABA很困難。目前報(bào)道的有紙層析法[14]、薄層掃描法[15]、氨基酸分析儀法[16]、毛細(xì)管電泳法[17]、高效液相色譜[18]及氣相色譜-質(zhì)譜法[19]等，其中高效液相色譜法可定量檢測(cè)GABA，相較氨基酸分析儀法成本低、分離時(shí)間短，是一種較為常用的方法。

谷氨酸脫羧酶基因gadB來(lái)源于菌株Streptococcus thermophilus Y2，將其與E. coli表達(dá)載體pET-23a連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入E. coli，獲得gadB基因工程菌E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB][20]。利用該基因工程菌催化L-谷氨酸鈉生成GABA，通過(guò)研究溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質(zhì)量比以及反應(yīng)體系體積對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響，確定該菌株轉(zhuǎn)化合成GABA的最佳轉(zhuǎn)化條件，通過(guò)在此最佳轉(zhuǎn)化條件下合成GABA，以期提高GABA轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法高效制備GABA的目的。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

Escherichia coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程研究室保藏。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，加水溶解后，加去離子水定容到1 000 mL。使用時(shí)向其中添加經(jīng)過(guò)濾除菌的氨芐青霉素，抗生素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

GABA（純度≥99%）、丹磺酰氯 美國(guó)Sigma公司；曲拉通X-100 廣東光華科技股份有限公司；四氫呋喃（色譜純）、丙酮 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HYG-A全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；AY120電子精密天平 日本Shimadzu公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；手提式蒸汽壓力滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠(chǎng)；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf基因公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；Agilent 1100 series高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 重組大腸桿菌細(xì)胞的制備

1.3.1.1 培養(yǎng)條件

轉(zhuǎn)接甘油凍存菌E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h至對(duì)數(shù)期備用，將種子液按3%的接種量接入300 mL的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm= 0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷至其終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL，16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)16 h以上。

1.3.1.2 菌懸液的制備

將發(fā)酵液在4 ℃于8 000×g離心10 min，棄上清液，得到菌體沉淀。用9 g/L的生理鹽水重懸菌體2 次，按照10 倍濃縮發(fā)酵液的比例加入已滅菌的生理鹽水，反復(fù)吹打制得菌懸液，加入甘油置于－20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 重組大腸桿菌細(xì)胞合成GABA轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

分別對(duì)轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH值、表面活性劑處理、金屬離子處理、底物與菌體質(zhì)量比、反應(yīng)體系體積進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，然后在最優(yōu)條件下測(cè)定轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響。

以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，于37 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h，取上清液凍存待測(cè)。

1.3.3 GABA含量的測(cè)定

1.3.3.1 色譜條件[21-25]

GABA的高效液相色譜檢測(cè)條件：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)時(shí)間：45 min；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為四氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（pH 6.2，體積比5∶75∶420）。

1.3.3.2 樣品處理及衍生化

取冰箱中保存的待測(cè)樣品20 μL，用0.1 mol/L（pH 9.8）的碳酸氫鈉緩沖液稀釋10 倍，然后加入0.2 mL等量的（4 g/L）丹磺酰氯（1-二甲氨基-萘-5-磺酰氯，DNS-Cl）丙酮溶液，置于37 ℃條件下避光衍生化反應(yīng)1 h，DNS-Cl能與氨基酸的一級(jí)胺、二級(jí)胺、巰基、咪唑基和酚羥基縮合，生成DNS-GABA衍生物，衍生結(jié)束后過(guò)0.22 μm濾膜待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適預(yù)處理溫度與時(shí)間

在轉(zhuǎn)化之前，把菌體在55、60 ℃分別處理1.5、3、6、12、24 h，并設(shè)置未加熱處理對(duì)照組。在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在37 ℃條件下反應(yīng)2 h，測(cè)定在不同溫度與不同時(shí)間熱處理?xiàng)l件下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖1所示，菌體經(jīng)過(guò)熱處理后，GABA轉(zhuǎn)化效率明顯提高，其中效果最好為55 ℃處理1.5 h，GABA轉(zhuǎn)化效率由3.6 g/（g?h）提高到8.0 g/（g?h），提高了1.2 倍。55 ℃處理1.5～24 h時(shí)GABA轉(zhuǎn)化效率均高于對(duì)照組，說(shuō)明熱處理對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的提高具有促進(jìn)作用，原因可能是熱處理使得菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加疏松，有利于與底物充分進(jìn)行反應(yīng)，使得GABA轉(zhuǎn)化效率提高。以55、60 ℃條件對(duì)菌體進(jìn)行熱處理，GABA轉(zhuǎn)化效率均隨處理時(shí)間的增加而降低，這是由于熱處理時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致工程菌中GAD酶活性的下降，從而降低GABA轉(zhuǎn)化效率。

圖1 熱處理對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effect of heat treatment on the productivity of GABA

2.2 最適轉(zhuǎn)化溫度

圖2 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of temperature on the productivity of GABA

實(shí)驗(yàn)選取28～55 ℃進(jìn)行研究，在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在不同溫度下反應(yīng)1 h，測(cè)定在不同溫度下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖2所示，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高而升高，在45 ℃達(dá)到最高，GABA轉(zhuǎn)化效率為6.1 g/（g?h），45 ℃以后GABA轉(zhuǎn)化效率隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高而降低，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高使得GAD酶活性下降，可見(jiàn)GAD催化合成GABA的最適轉(zhuǎn)化溫度為45 ℃。

2.3 最適轉(zhuǎn)化pH值

研究認(rèn)為GAD賦予微生物細(xì)胞對(duì)酸性環(huán)境的抵抗能力，微生物在缺氧、酸性等不利條件下，GAD催化酸性谷氨酸變成中性GABA，進(jìn)而維持細(xì)胞處于pH值較穩(wěn)定的環(huán)境中[26]。實(shí)驗(yàn)選取pH 3.0～5.0進(jìn)行研究，在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)不同pH值，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定在不同pH值條件下GABA轉(zhuǎn)化效率。

圖3 轉(zhuǎn)化pH值對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effect of pH on the productivity of GABA

如圖3所示，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，pH值為4.5時(shí)GABA轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大，為6.25 g/（g?h），可見(jiàn)pH 4.5時(shí)GAD酶活性最高，與已報(bào)道的微生物來(lái)源的GAD反應(yīng)最適pH 3.8～5.0之間[27]基本一致。pH值在3.0、3.5時(shí)，GABA轉(zhuǎn)化效率很小，可能是pH值過(guò)低抑制了GAD酶活性及細(xì)胞的通透性，繼而影響GABA的轉(zhuǎn)化效率。

2.4 不同表面活性劑對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響

表面活性劑可以增加細(xì)胞的通透性，同時(shí)表面活性劑也可能是酶的促進(jìn)劑或抑制劑。實(shí)驗(yàn)選取了表面活性劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫-80和Triton-100進(jìn)行處理。

圖4 不同表面活性劑對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of surfactants on the productivity of GABA

在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，測(cè)定在不同表面活性劑處理下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖4所示，吐溫-80對(duì) GABA的合成具有抑制作用，SDS嚴(yán)重抑制了GABA的合成。Triton-100對(duì)GABA的合成具有促進(jìn)作用，因此選取Triton-100作為GABA合成促進(jìn)因子，并對(duì)其添加量進(jìn)行優(yōu)化。

測(cè)定添加不同Triton-100添加量處理下GABA轉(zhuǎn)化效率，如圖5所示，在Triton-100體積分?jǐn)?shù)小于0.02%時(shí)，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著Triton-100添加量的增加而升高，在Triton-100體積分?jǐn)?shù)大于0.02%時(shí)GABA轉(zhuǎn)化效率增加較為緩慢并趨于穩(wěn)定，在Triton-100體積分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，GABA轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，為12.6 g/（g?h），提高了1.3 倍，效果顯著，因此Triton-100添加的最適體積分?jǐn)?shù)為0.06%。

圖5 Triton-100添加量對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effect of Triton-100 concentration on the productivity of GABA

2.5 不同金屬離子對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響

金屬離子可能是酶活性中心的組成部分，可以與酶螯合成絡(luò)合物以維持酶三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子構(gòu)象穩(wěn)定，也可能是和底物結(jié)合催化反應(yīng)有關(guān)[28]。為了考察金屬離子對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響，本實(shí)驗(yàn)探討Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Fe3+10 種金屬離子對(duì)GABA轉(zhuǎn)化率的影響，這些金屬離子分別來(lái)自于MgCl2、CaCl2、BaCl2、MnCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl2、CoCl2、ZnCl2、FeCl3，濃度分別選取5、50 mmol/L。

在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3 mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定在不同金屬離子處理下GABA轉(zhuǎn)化效率。

圖6 不同金屬離子對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effect of metal ions on the productivity of GABA

如圖6所示，10 種金屬離子添加量為50 mmol/L時(shí)均對(duì)GABA的合成具有抑制作用，說(shuō)明高濃度的金屬離子可能對(duì)微生物細(xì)胞具有損傷作用。金屬離子添加量為5 mmol/L時(shí)，Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+對(duì)GABA的合成具有抑制作用，Ba2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+對(duì)GABA的合成有促進(jìn)作用，其中Cu2+、Ni2+效果明顯。在植物中，GAD被認(rèn)為是感受Ca2+信號(hào)的壓力調(diào)節(jié)伴侶蛋白，敲除CaM結(jié)合區(qū)域?qū)?huì)導(dǎo)致GAD活性的下降，并會(huì)嚴(yán)重影響植物的發(fā)育[26]，細(xì)菌GAD結(jié)構(gòu)特征類(lèi)似于植物[29]，為了研究細(xì)菌GAD受Ca2+激活是否類(lèi)似于植物GAD，測(cè)定Ca2+、Cu2+、Ni2+3 種離子添加量為低濃度時(shí)對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響。

圖7 Cu2+、Ni2+濃度對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.7 Effects of Cu2+2+and Ni2+2+concentrations on the productivity of GABA

圖8 Ca 8 Ca2+2+濃度對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.8 Effect of Ca2+2+concentration on the productivity of GABA

測(cè)定Ca2+、Cu2+、Ni2+3 種金屬離子在不同濃度添加量下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖7、8所示，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著3 種金屬離子濃度的增加均呈先增加后減小趨勢(shì)，但最適濃度不一致，其中促進(jìn)效果最好的為Ca2+，最適濃度為0.6 mmol/L，GABA轉(zhuǎn)化效率從6.0 g/（g?h）增加到9.2 g/（g?h），提高了53.3%；其次為Ni2+，最適濃度為6 mmol/L，GABA轉(zhuǎn)化效率提高了28.0%；再次為Cu2+，最適濃度為10 mmol/L，GABA轉(zhuǎn)化效率提高了21.8%。

2.6 最適底物與菌體質(zhì)量比

圖9 底物與菌體質(zhì)量比對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.9 Effect of mass ratio between substrate and bacterial cells on the productivity of GABA

在29.55 mL反應(yīng)體系中，以26.55 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以不同體積菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在37 ℃反應(yīng)1 h，測(cè)定底物與菌體不同質(zhì)量比條件下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖9所示，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著底物與菌體質(zhì)量比增加呈先增加后減小的趨勢(shì)，在底物與菌體質(zhì)量比為9∶1時(shí)GABA轉(zhuǎn)化效率最大，達(dá)到5.6 g/（g?h），因此選取9∶1為最適底物與菌體質(zhì)量比。

2.7 最適反應(yīng)體系體積

保持底物質(zhì)量與菌體質(zhì)量比為9∶1，設(shè)置反應(yīng)轉(zhuǎn)化液不同體積：5、10、15、20、25、30、35 mL，以濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以不同體積菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定在不同反應(yīng)體系體積下GABA轉(zhuǎn)化效率。如圖10所示，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著反應(yīng)體系體積的增加而降低，原因可能是反應(yīng)體系體積小時(shí)，菌體與底物的接觸機(jī)會(huì)較多，轉(zhuǎn)化效率高。當(dāng)反應(yīng)體系體積大于25 mL時(shí)，GABA轉(zhuǎn)化效率下降較為緩慢，趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。因此，選取5 mL為最適反應(yīng)體系。

圖10 反應(yīng)體系體積對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.10 Effect of reaction system volume on the productivity of GABA

2.8 最優(yōu)條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響

為了探索轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化效率的影響，研究1～10 h不同轉(zhuǎn)化時(shí)間下GABA轉(zhuǎn)化效率和合成量的變化。

圖11 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率和合成量的影響Fig.11 Effect of reaction time on the productivity and yield of GABA

由上述單因素優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳反應(yīng)條件組合：以5 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以6.4 mg菌體為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在反應(yīng)體系中加入體積分?jǐn)?shù)為0.06%的Triton-100，并加入濃度為0.6 mmol/L的Ca2+，在45 ℃條件下反應(yīng)10 h。由圖11可知，GABA轉(zhuǎn)化效率隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加而減小，1～4 h，GABA轉(zhuǎn)化效率下降較為明顯，4～10 h，GABA轉(zhuǎn)化效率下降較為緩慢，1 h時(shí)GABA轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到13.8 g/（g?h），優(yōu)化前GABA轉(zhuǎn)化效率為5.6 g/（g?h），優(yōu)化后使得GABA轉(zhuǎn)化效率提高1.5 倍，優(yōu)化效果較好。

GABA合成量隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈先增加后減小趨勢(shì)，GABA合成量在1 h時(shí)增加最多，達(dá)到16.0 g/L，1～7 h GABA合成量緩慢增加，反應(yīng)時(shí)間為7 h時(shí)GABA合成量最高，為26.1 g/L，7 h以后GABA合成量緩慢減小，可能是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，底物和菌體均會(huì)減少，而產(chǎn)物GABA逐漸積累，反應(yīng)一定時(shí)間后，底物被消耗完全，且產(chǎn)物 GABA被反應(yīng)體系中某些物質(zhì)消耗，從而導(dǎo)致GABA合成量的減小。

3 結(jié) 論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株E. coli BL21（DE3）-[pET-23a-gadB]進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，該菌株是高效表達(dá)GAD的基因工程菌，本菌株打破了乳酸菌野生菌株GAD本底表達(dá)量不高所導(dǎo)致的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率不高的限制，借助大腸桿菌GAD表達(dá)具有可人工調(diào)控、生長(zhǎng)迅速以及易于高密度培養(yǎng)等頗多優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到高效率生產(chǎn)GABA的目的。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)重組谷氨酸脫羧酶細(xì)胞生物合成GABA轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到最佳轉(zhuǎn)化條件為：以5 mL濃度為0.1 mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以6.4 mg菌體為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)pH值為4.5，在反應(yīng)體系中加入體積分?jǐn)?shù)為0.06%的Triton-100，并加入濃度為0.6 mmol/L的Ca2+，在45 ℃條件下反應(yīng)7 h，GABA合成量達(dá)到26.1 g/L。王期等[30]利用工程菌粗酶液以L(fǎng)-谷氨酸鈉為底物催化合成GABA，GABA生成量達(dá)到19.57 g/L，本實(shí)驗(yàn)所得到的GABA生成量略高于此研究。

GABA轉(zhuǎn)化效率在1 h時(shí)達(dá)到最高，為13.8 g/（g?h），優(yōu)化前GABA轉(zhuǎn)化效率為5.6 g/（g?h），優(yōu)化后使得GABA轉(zhuǎn)化效率提高1.5 倍，優(yōu)化條件中pH值對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率影響較大，因此控制底物轉(zhuǎn)化液pH值較為關(guān)鍵，pH值過(guò)高或過(guò)低均不利于GABA的生成，因pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響酶活性。此外，添加低濃度的表面活性劑Triton-100對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的提高效果顯著，最佳添加量為0.06%，GABA轉(zhuǎn)化效率較對(duì)照組提高1.3 倍，這可能是因?yàn)門(mén)riton-100增加了細(xì)胞膜的通透性，使得底物更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，而產(chǎn)物GABA更易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞外。本實(shí)驗(yàn)主要考察了單因素對(duì)GABA轉(zhuǎn)化效率的影響，未對(duì)因素間的交互作用做出研究，還有待進(jìn)一步探索。

田靈芝等[31]利用重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成GABA，在最優(yōu)條件下，批次添加底物L(fēng)-谷氨酸共600 g，5 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化24 h，GABA累計(jì)質(zhì)量濃度高達(dá)204.5 g/L，以物質(zhì)的量計(jì)，轉(zhuǎn)化率為 97.92%，說(shuō)明用發(fā)酵罐生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量很高，因此本課題組下一步研究將在發(fā)酵罐的水平上進(jìn)行。

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Optimization of Conversion Conditions for Biosynthesizing γ-Aminobutyric Acid by Recombinant Glutamate Decarboxylase from Escherichia coli

CHEN Lin, ZHANG Chong, Lü Fengxia, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, LU Zhaoxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The conditions for the synthesis of γ-aminob utyric acid (GABA) using glutamate decarboxylase from recombinant E. coli cells were optimized in this work. The effects of temperature, pH, surfactants, metal ions, the ratio of substrate and cells and the transformation system volume on the productivity of GABA were studied. Results indicated that the optimal reaction system volume was 5 mL containing 0.1 mol/L sodium glutamate as the substrate, 6.4 mg of E. coli cells (dry weight), 0.06% Triton-100 (volume fraction) and 0.6 mmol/L Ca2+at pH 4.5. The reaction was allowed to proceed for 7 h at 45 ℃. Under these optimal conditions, the yield of GABA was 26.1 g/L. The transformation effi ciency of GABA reached the highest level of 13.8 g/(g·h) after 1 h reaction, which is 2.5 times higher than that observed before optimization.

γ-aminobutyric acid (GABA); glutamate decarboxylase; conversion conditions; optimization

Q939.9

A

1002-6630（2015）01-0158-06

10.7506/spkx1002-6630-201501030

2014-03-03

陳琳（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2013108025@njau.edu.cn

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛吧锛夹g(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn