祖雄林，周旭，陳金波，崔雨，齊琳

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.國(guó)際醫(yī)療部；2.泌尿外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

·論著·

膀胱癌中miR-128與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C的靶向調(diào)控關(guān)系

祖雄林1，周旭2，陳金波2，崔雨2，齊琳2

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院1.國(guó)際醫(yī)療部；2.泌尿外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

目的研究人膀胱尿路上皮癌細(xì)胞和組織中的miR-128與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）的靶向調(diào)控關(guān)系及其生物學(xué)功能。方法收集9對(duì)配對(duì)的膀胱癌組織和其癌旁組織，1株人正常尿路上皮細(xì)胞（SV-HUC-1）和4株膀胱癌細(xì)胞（T24、5637、UM-UC-3和RT4），通過RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)VEGF-C和miR-128的表達(dá)水平；將miR-128復(fù)合物或miR-128抑制劑等復(fù)合物轉(zhuǎn)染到2株膀胱癌T24和5637細(xì)胞中，檢測(cè)miR-128對(duì)其生長(zhǎng)、遷移及侵襲的影響；生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析miR-128的靶基因，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-128是否靶向作用VEGF-C。結(jié)果相比癌旁組織和正常尿路上皮細(xì)胞，膀胱癌組織和細(xì)胞中miR-128的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而VEGF-C在癌組織和細(xì)胞中都呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.05）。miR-128可抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成及遷移侵襲（P＜0.05）。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-128靶向作用VEGF-C（P＜0.05）。結(jié)論miR-128在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)，而VEGF-C表達(dá)上調(diào)；miR-128可通過靶向調(diào)控VEGF-C影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

miR-128；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；膀胱癌；靶向調(diào)控

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿生殖系發(fā)病率第二的腫瘤[1]。大約有50%的患者被診斷為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，伴有肺部和肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5年生存率較低[2]。目前，進(jìn)一步提高生存率的治療方法比較有限，腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制目前沒有明確。

小分子核糖核酸（microRNA）是內(nèi)源性的微小RNA分子，通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生中扮演重要的角色。微小RNA128（microRNA128，miR-128）是一種雙面miRNA，目前在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中研究最多。它可以通過靶向作用于Bmi-1（B-cell specific moloney leukemiavirus insertion site 1，Bmi-1）、E2F3a（E2F transcription factor 3 a，E2F3a）和促有絲分裂的激酶抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[3]。此外，miR-128可靶向作用于p70S6K1（p70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1）抑制腫瘤生長(zhǎng)和血管生成[4]，在大多數(shù)情況下，miR-128是抑癌基因，例如miR-128可降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌細(xì)胞的能動(dòng)性和侵襲性[5-6]。但目前還罕有關(guān)于miR-128在膀胱癌中的作用的報(bào)道。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor c，VEGF-C）與血管生成、淋巴管生成和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，被報(bào)道有抗凋亡和增殖的作用[7]。RNA干擾VEGF-C能抑制惡性進(jìn)展和提高絲裂霉素C對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的敏感性[8]，但膀胱癌中miR-128和VEGF-C之間的關(guān)系仍然未知。因此，本研究擬確定膀胱癌組織和細(xì)胞中miR-128和VEGF-C的表達(dá)水平，研究miR-128在5637、T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。驗(yàn)證在T24和5637細(xì)胞株中，miR-128與VEGF-C的靶向作用關(guān)系，為膀胱癌的診斷或治療尋找新的分子靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1材料

選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院泌尿外科2013年10月-2014年4月的9例膀胱癌患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本，均來(lái)自于膀胱腫瘤患者的手術(shù)切除組織。取術(shù)中切除的膀胱腫瘤組織，同時(shí)隨機(jī)采取于距離腫瘤邊緣2 cm以外的癌旁組織。所有標(biāo)本均由病理科醫(yī)生根據(jù)組織切片作出病理診斷為膀胱癌。所有患者術(shù)前未行放療和化療。膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、UM-UC-3、RT4及正常尿路上皮細(xì)胞系SV-HUC-1等細(xì)胞株均購(gòu)自于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心及代購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)按照說(shuō)明書步驟用Trizol試劑從細(xì)胞試劑盒中提取收集細(xì)胞、膀胱癌組織及癌旁組織中的總RNA，選取A260/A280比值在1.8～2.0之間的RNA標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real time PCR）檢測(cè)miR-128和VEGF-C的相對(duì)表達(dá)量。特殊引物miR-128（HmiRQP3056）和U6（HmiRQP9001）、miR-128復(fù)合物（miR-128 mimics）或抑制劑（inhibitor）及陰性對(duì)照組（negative control，nc）由廣州復(fù)能公司合成。配對(duì)引物序列具體如下：VEGF-C轉(zhuǎn)錄引物：5'-CACGAGCTACCTCAGCAAG A-3'，逆轉(zhuǎn)錄引物：5'-GCTGCCTGACACTGTGGTA-3'；β-actin作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)錄引物：5'-AGGGGCCGGA CTCGTCATACT-3'和逆轉(zhuǎn)錄物：5'-GGCGGCACCA CCATGTACCCT-3'。使用GraphPad Prism 4.0軟件和2-ΔΔCt求基因相當(dāng)表達(dá)量方法，分析VEGF-C mRNA和mir-128的表達(dá)水平。

1.2.2蛋白分離和免疫印跡試驗(yàn)通過免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行量化分析。采用凝膠電泳等方法處理蛋白樣本，然后用β-actin（1∶500）兔多克隆抗體，anti-VEGF-C（1∶500）兔多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。適量TBST溶液漂洗10 min× 3次后，暗室內(nèi)浸入ECL液顯色，并使膠片曝光，定影，洗片。由凝膠圖像掃描系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶膠片進(jìn)行密度掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對(duì)圖像進(jìn)行曝光灰度分析。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照說(shuō)明書使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染12 h前先將細(xì)胞鋪到六孔板中。高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、miR-128 mimics或miR-128 inhibitor入膀胱癌T24和5637細(xì)胞中，在培養(yǎng)箱中孵育48 h，以利下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行miR-128的功能分析。

1.2.4細(xì)胞增殖試驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力是通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法來(lái)檢測(cè)的。取轉(zhuǎn)染后的膀胱癌T24或5637細(xì)胞，細(xì)胞分組（NC、inhibitor或mimics組）進(jìn)行消化，調(diào)制成細(xì)胞懸液，鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞。在每個(gè)反應(yīng)孔加入20μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，再去上清液，每孔加入150μl DMSO溶液沉淀，培養(yǎng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

1.2.5 平板克隆形成試驗(yàn)膀胱癌T24、5637細(xì)胞分組（NC、inhibitor或mimics組）進(jìn)行消化，調(diào)制成細(xì)胞懸液，按照50個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液接種到每個(gè)六孔培養(yǎng)板中。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后漂洗染色，培養(yǎng)條件為37℃，5%二氧化碳CO2?？寺∮?jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率，比較克隆形成能力。

1.2.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)膀胱癌細(xì)胞體外侵襲能力的評(píng)估在24孔板Transwell小室中進(jìn)行。細(xì)胞分組及準(zhǔn)備如前所述，加入200μl細(xì)胞懸液（1×106細(xì)胞/ml）至小室內(nèi)。培養(yǎng)染色后，沖洗干燥Transwell小室，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。

1.2.7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)使用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)其劃痕修復(fù)情況。劃痕寬度約1 mm，在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞清洗和培養(yǎng)。以劃痕時(shí)間為起點(diǎn)，在0、24和48 h分別在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞劃痕修復(fù)情況。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告分析軟件預(yù)測(cè)顯示VEGF-C基因的3-UTR包含mir-128的結(jié)合位點(diǎn)，通過DNA聚合酶以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR克隆擴(kuò)增。再在NotⅠ和XhoⅠ這2個(gè)酶切位點(diǎn)間插入到psiCHECKTM-2質(zhì)粒中，其相應(yīng)的突變序列克隆到psi-CHECKtm-2，分別名叫VEGF-C-3'-UTR和Mut-VEGF-C-3'-UTR。使用脂質(zhì)體2000（表達(dá)載體），T24、5637細(xì)胞共轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒和miR-128模擬物，miR-128抑制劑，陰性對(duì)照組或陰性對(duì)照抑制劑等。熒光素酶活性被確定于48 h后，使用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行樣品熒光素酶的活性檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1miR-128和VEGF-C的表達(dá)

miR-128在膀胱癌組織和癌細(xì)胞中低表達(dá)，而VEGF-C則是高表達(dá)。相比鄰近正常組織，膀胱癌組織中miR-128的mRNA水平明顯低于正常組織，而VEGF-C的mRNA水平是相反的（P＜0.05，圖1A和2A）。與此同時(shí)，與正常膀胱移行上皮細(xì)胞株SV-HUC-1相比，膀胱癌細(xì)胞中可見mir-128表達(dá)下調(diào)和VEGF-C表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，圖1B和2B）。免疫印跡分析，與癌旁組織和SV-HUC-1相比，膀胱癌組織和癌細(xì)胞株的VEGF-C蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05，圖2C和2D）。這些結(jié)果表明，在膀胱癌的惡性進(jìn)展中，miR-128可能發(fā)揮了重要作用。此外，VEGF-C上調(diào)和miR-128下調(diào)的共存提示膀胱癌細(xì)胞中潛在的調(diào)控相關(guān)性。

圖1 miR-128 mRNA的表達(dá)水平比較

2.2miR-128的過表達(dá)可以減少膀胱癌T24和5637細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)

通過體外轉(zhuǎn)染miR-128 mimic的方式來(lái)進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，了解miR-128在膀胱癌T24、5637細(xì)胞中的功能。轉(zhuǎn)染pre-mir-128后，mir-128的mRNA水平顯著上調(diào)而VEGF-C的mRNA水平下調(diào)（P＜0.05）。與之相反，當(dāng)轉(zhuǎn)染anti-mir-128，mir-128的mRNA水平下調(diào)和VEGF-C的mRNA水平上調(diào)（P＜0.05）。這表明mir-128的過表達(dá)可以減少膀胱癌T24和5637細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)。見圖3。

圖2 VEGF-C mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較

圖3 mir-128和VEGF-C在膀胱癌T24和5637細(xì)胞功能模型中的表達(dá)

2.3 miR-128在膀胱癌T24和5637細(xì)胞中直接靶向作用VEGF-C

克隆擴(kuò)增包含miR-128結(jié)合位點(diǎn)的VEGF-C-3-UTR片段和變異的目標(biāo)序列，通過psi-CHECK2雙熒光素酶報(bào)告基因載體，共轉(zhuǎn)染miR-128復(fù)合物到膀胱癌T24和5637細(xì)胞。結(jié)果顯示，miR-128模擬物抑制轉(zhuǎn)染了野生型即VEGF-C-3-UTR的T24和5637細(xì)胞的熒光素酶活性。然而，miR-128模擬物沒有抑制轉(zhuǎn)染了突變型即Mut-VEGF-C-3-UTR的T24和5637細(xì)胞的熒光素酶活性，見圖4。這證實(shí)了VEGF-C是miR-128的直接靶基因。

2.4miR-128抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力

為了解miR-128對(duì)細(xì)胞的影響，通過miR-128模擬物或其抑制劑轉(zhuǎn)染膀胱癌T24和5637細(xì)胞，利用MTT比色實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成能力，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比，膀胱癌細(xì)胞中miR-128的過表達(dá)顯著降低了T24和5637細(xì)胞的生長(zhǎng)率（圖5A和5B）和克隆形成能力（圖5C和5D）。然而，相比陰性對(duì)照組，miR-128轉(zhuǎn)染抑制劑組細(xì)胞的生長(zhǎng)率和克隆形成顯著增加。它表明miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

2.5miR-128抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

通過Transwell小室和劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，當(dāng)膀胱癌T24和5637細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-128過表達(dá)物后，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯更強(qiáng)，當(dāng)膀胱癌T24和5637細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-128抑制劑后，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低，見圖6。結(jié)果表明，miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖4 mir-128反向調(diào)控VEGF-C的表達(dá)

圖5 miR-128對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

圖6 miR-128對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見腫瘤，膀胱癌患者多以尿路上皮細(xì)胞癌的病理類型居多，具有易浸潤(rùn)、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[9]。目前，在已有的治療方案下提高存活率的進(jìn)展是有限的，這很大程度上是由于致腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制還不是很清楚。因此，探索關(guān)鍵因素介導(dǎo)的膀胱癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效的治療很重要。研究人員一直在尋找新的生物標(biāo)志物，其中一個(gè)重要的研究方向是microRNAs（miRNAs）在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)及作用。

MiRNAs是不翻譯成蛋白的小RNA分子，成熟的miRNA約18～22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。研究發(fā)現(xiàn)這些miRNA表達(dá)情況不僅在惡性腫瘤與正常組織之間存在差異表達(dá)，在不同類型的癌癥之間及相同癌癥的不同亞型都不同[10]。因此，miRNAs被認(rèn)為具有成為癌癥早期診斷或預(yù)測(cè)生物標(biāo)記的潛力，它們或許能作為不同腫瘤疾病的治療靶點(diǎn)[11]。在不同組織或細(xì)胞中，miR-128被發(fā)現(xiàn)是一種有雙面性的微小RNA。在大多數(shù)情況下，它作為抑癌基因，其功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和耐藥性，但對(duì)其在膀胱癌的表達(dá)和功能研究是非常有限的[12]。

本研究檢測(cè)了9例膀胱癌組織及癌旁組織中miR-128的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，相比癌旁組織，miR-128在膀胱癌中的表達(dá)顯著降低。與此同時(shí)，與正常尿路上皮細(xì)胞相比，它在4株膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)。這表明，在膀胱癌中，miR-128可能是一個(gè)抑癌基因。分別在膀胱癌T24和5637細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pre-mir-128和anti-mir-128，構(gòu)建了功能獲取和功能抑制的細(xì)胞模型，以進(jìn)一步研究mir-128在膀胱癌中的生物學(xué)功能。使用MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成試驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖、遷移和侵襲能力。這些結(jié)果與之前在其他腫瘤中的研究是一致的[5，13]。

VEGF-C與血管生成、淋巴管生成和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，被報(bào)道有抑制凋亡和增殖的作用[14]。由生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，VEGF-C是miR-128的目標(biāo)基因之一，并且在部分腫瘤中得到了驗(yàn)證。在人類非小細(xì)胞肺癌的腫瘤生成、血管生成和淋巴管生成中，miR-128可直接靶向作用于VEGF-C，并起著至關(guān)重要的作用[15]，但是miR-128、VEGF-C之間的關(guān)系在膀胱癌中仍然是未知的。本研究使用雙熒光素酶基因報(bào)告分析，驗(yàn)證了膀胱癌T24和5637細(xì)胞中miR-128和VEGF-C之間的直接靶向關(guān)系。

綜上所述，本研究初步證明了膀胱癌組織和細(xì)胞中，miR-128是顯著下調(diào)的，而VEGF-C顯著上調(diào)；膀胱癌細(xì)胞中miR-128直接靶向作用于VEGF-C，從而影響膀胱癌的進(jìn)展。這說(shuō)明miR-128可作為膀胱癌診療的一個(gè)新方向。雖然本研究提示了膀胱癌中miR-128靶向調(diào)控VEGF-C這一信號(hào)通路可能的分子機(jī)制，但是還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明其具體機(jī)制。下一步將采取加大樣本量、構(gòu)建VEGF-C穩(wěn)定沉默的細(xì)胞模型和進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)深入探討miR-128在膀胱癌中的生物學(xué)功能、作用機(jī)制及臨床意義。

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（王榮兵 編輯）

Mir-128 is down-regulated in bladder cancer and inhibits tumor cell proliferation by targeting VEGF-C

Xiong-lin ZU1,Xu ZHOU2,Jin-bo CHEN2,Yu CUI2,Lin QI2
(1.International Medical Center;2.Department of Urology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the regulation of miR-128 on VEGF-C expression and its biological effect in bladder cancer.【Methods】Materials including 9 pairs of bladder cancer tissues and adjacent tissues,4 bladder caner cell lines(T24,5637,UM-UC-3,RT4)and 1 normal urothelial cell(SV-HUC-1)were collected.The miR-128 and VEGF-C mRNA and protein expression were tested by RT-PCR and Western blot,respectively.The miR-128 minics and miR-128 inhibitor were transfected into bladder cancer cells T24 and 5637 through lipidosome.And the effect of miR-128 on bladder urothelial cancer cells proliferation,invasion and metastasis were tested.Target gene of miR-128 analysis was applied by related biological information software.Dual luciferase reporter gene assay verified targeted relationship between miR-128 and VEGF-C.【Results】We found miR-128 was down-regulated in bladder cancer tissues and cell lines which was opposite from the expression of VEGF-C(P<0.05).Overexpression of miR-128 could inhibit proliferation,migration and invasion of bladder cancer cells(P<0.05).Dual luciferase reporter gene assay showed VEGF-C was a direct target of miR-128 in bladder cancer cells(P<0.05).【Conclusions】miR-128 was down-regulated in bladder cancer,meanwhile VEGF-C was up-regulated.MiR-128 downregulation can promote the growth and metastasis of bladder cancer cells by involving VEGF-C up-regulation.

miR-128;VEGF-C;bladder cancer;target regulating

R737.14

A

1005-8982（2015）25-0038-07

2015-06-10

周旭，E-mail：zx315zx@163.com