邸仕忠，孫小紅，羅永統(tǒng)，陳維竟，彭福英，彭福佳，楊 飛

（1.重慶市渝東南農業(yè)科學院 特種作物研究所，重慶 涪陵 408000；2.長江師范學院 生命科學與技術學院，重慶 涪陵 408100）

近年來，隨著國家調整玉米產業(yè)體系相關政策方針的出臺，“國務院關于加快推進現(xiàn)代農作物種業(yè)發(fā)展的意見（2011國務院8號文件）”的實施和推進，及大量國外種業(yè)巨頭進入中國，玉米育種競爭趨于白熱化，各育種單位均在積極進行材料創(chuàng)新［1］.但我國玉米育種長期依賴于少數骨干材料，新選的自交系和雜交種同質化嚴重，甚至出現(xiàn)個別單位和個人盜取他人親本、雜交種套牌等不良現(xiàn)象［2－4］.因此，在進行自交系選育的同時，利用分子標記檢測其遺傳多樣性，構建自交系的DNA指紋圖譜，不僅可以了解材料間的遺傳基礎、親緣關系和雜優(yōu)類群，還可以保護自交系的品種權免受侵犯［5］.SSR（simple sequence repeat）技術因其信息含量高、呈共顯性、易于操作等特點，已被廣泛應用于許多作物的DNA指紋圖譜構建［2－4］.譚君［6］、趙久然等［7－9］分別對西南地區(qū)玉米自交系和中國玉米新品種進行了 DNA 指紋庫建立，初步建立了一套適用于自交系和玉米品種鑒定的SSR標準體系，但未見重慶地區(qū)玉米自交系DNA指紋圖譜方面的研究.作者利用SSR分子標記技術構建重慶市部分常用及新選育優(yōu)良自交系的指紋圖譜，分析其遺傳多樣性，為自交系的改良提供依據并為保護其知識產權奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用重慶市渝東南農科院新選自交系61份，各亞群代表自交系5個，自交系名稱編號見表1.

表1 66個自交系名稱及編號Tab.1 The materials used in study and their resource

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

采用砂培法培養(yǎng)玉米幼苗，每個樣品取15株葉片混合后，采用2×CTAB法提取并純化基因組 DNA［11］.

1.2.2 PCR擴增

采用10μL PCR體系，包括1×buffer，2.5μmol·L－1MgCl2、150μmol·L－1dNTPs、0.2μmol·L－1引物、1UTaq酶和100ng DNA模板.將反應液在振蕩器混勻后，加入20μL液體石蠟覆蓋.反應程序為：94℃預變性5min，1個循環(huán)；94℃預變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保存.

1.2.3 電泳、銀染

在擴增產物中加入2μL 3×SGB（98%去離子甲酰胺；10mM EDTA，pH 8.0；0.025%溴酚藍；0.025%二甲苯青）.每個樣取4.5μL，在1×TBE緩沖液條件下，用6%的聚丙烯酰胺變性的凝膠進行電泳，恒定功率75W預電泳約30rain，75W電泳約1h.銀染參照辛景樹［9］的程序進行.

1.2.4 引物的選擇

結合已有的研究基礎，參照北京市玉米親本鑒定地方標準“DB11／T 507－2007”中玉米品種純度及真實性SSR分子檢測方法，選擇40對SSR核心引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 數據統(tǒng)計分析

根據PCR擴增結果，對表現(xiàn)出多態(tài)性的擴增帶數量化：在相同遷移位置有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失數據記為“9”，建立數據庫.以簡單相配系數（simple matching coefficient，簡稱SM）計算自交系的遺傳相似值（genetic similarity，簡稱GS）［10］.GS＝m／（m＋n），m表示基因型共有帶數目；n表示基因型間差異帶數目.利用 NTSYS－pc version 2.1軟件進行數據處理，按 UPGMA方法（un－weighted pair group method using arithmetic averages）對供試自交系進行聚類.每個SSR位點的多態(tài)性信息（polymorphism information contention）按Smith等［11］的公式計算，即 PIC＝1－∑fi2，其中fi表示位點的基因頻率.

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記檢測結果

40對SSR核心引物中，32對PCR條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高.以此32對引物對66個玉米自交系進行PCR擴展及檢測，結果表明，在66個自交系中共檢測出155個條帶，每對引物檢測到條帶2～12個，平均為4.84個，其中多態(tài)性條帶占100%.每個位點的多態(tài)性信息量（PIC值）變幅為0.516～0.988，平均為0.721，其中引物bnlg2305的PIC最大，為0.988；引物umc2007的PIC最小，為0.516.擴增條帶數和PIC值結果見表2.供試自交系中遺傳相似系數變化范圍為0.54～0.88，平均值為0.68，多數遺傳相似系數都大于0.60，遺傳相似系數在0.60～0.70間分布最多，占60.33%.說明供試材料間有一定的遺傳差異.

表2 32對SSR引物在66個玉米自交系中檢測到的等位基因數、PIC值Tab.2 The number of alleles and PIC in the 66maize lines detected by 32pairs of SSR primer

續(xù)表2

2.2 引物的確定

評價32對引物在66份自交系間的帶型清晰度、多態(tài)性高低和帶型統(tǒng)計的難易程度，作為最終構建指紋圖譜的候選引物.再根據入選引物在每條染色體上均勻分布的原則，最終確定umc2105k3、phi072k4、umc1545y2、umc1125y3、phi080k15、umc1506k12、bnlg249k2、phi299852y2、umc1936k4 和bnlg2235y5等10對引物作為供試玉米自交系指紋圖譜構建的引物.10對引物對66個玉米自交系的檢測結果表明，10對引物共檢測出31個條帶，每對引物檢測到條帶3～4個，平均為3.10個，其中多態(tài)性條帶占100%，phi072k4條帶數最多為5個，每個位點的多態(tài)性信息量（PIC值）變幅為0.487～0.723，平均為0.651，說明這套引物具有較好的鑒別能力.圖1為引物umc2105不同條帶的帶型圖.

2.3 親本的指紋圖譜及數字化

利用10對引物對66份玉米代表品種構建指紋圖譜，特征條帶長度在149～432bp，轉化為數字指紋.66份玉米自交系間，相似系數在0.29～0.94之間，平均值為0.62.聚類分析表明，10對引物可將66份玉米自交系區(qū)分開來.根據趙久然等［8］提出假設同一引物的不同擴增帶型的基因頻率相同，即同一引物的不同等位基因等頻率出現(xiàn)的條件下，如果某個引物對的等位基因數是n，則該引物理論上可區(qū)分的最大自交系數為N＝n，最大雜交種數N＝1／2n（n＋1），出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝－I／N.該研究中確定的一套10個核心引物組合可區(qū)分的最大自交系數N＝N1×N2×…×N10＝10×6×6×6×6×6×6×6×6×6＝1.01×108，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝9.29×10－9.因此，可以利用這套引物構建重慶主要玉米自交系指紋.將篩選到的10對引物所擴增的片段數字化，使每一個親本的指紋圖譜都用相應的數字表示構成系譜各世代親本的身份證號碼，可以用于該自交系的真?zhèn)舞b定，結果列于表3.

表3 66份玉米自交系的數字化DNA指紋圖譜Tab.3 Digitizing DNA fingerprint of 66maize lines used in this study

續(xù)表3

3 討 論

近年來，隨著國家相關政策方針的出臺，加之大量國外種業(yè)巨頭進入中國，對玉米新品種權的保護及玉米品種的真實性和純度鑒定要求越來越高.SSR分子標記技術在玉米品種親緣關系和分類研究、品種的真實性和純度鑒定、新品種指紋圖譜構建、新品種的區(qū)試DUS測試、區(qū)試品種質量監(jiān)控等方面得到廣泛的應用，并發(fā)揮著越來越重要的作用［9］，目前已建立大量玉米自交系及雜交種的DNA指紋圖譜.譚君等［6］利用20對引物構建了西南地區(qū)常用的73份玉米自交系的SSR指紋圖譜.趙久然、辛景樹［7－8，10］等利用SSR分子標記構建了中國部分玉米新品種DNA指紋庫.李麗華等［11］利用9對SSR引物構建了四川農業(yè)大學玉米研究所20個玉米自交系的指紋圖譜.王偉等［12］利用20對SSR構建了貴州省2000年以來審定的48個玉米雜交種及其親本的指紋圖譜.邱紅波等［13］利用6對SSR引物構建了36份喀斯特高海拔山區(qū)玉米骨干自交系的指紋圖譜.劉濤等［14］利用SSR分子標記技術研究了黔東南地方玉米品種，利用4對多態(tài)信息量高的引物建立了21個地方品種的DNA指紋圖譜.蓋樹鵬等［15］分別利用10對和20對適于玉米自交系和雜交種分析的核心引物，構建了山東省35份骨干自交系和19份主栽雜交種的SSR指紋圖譜.該文作者的試驗結果表明，32對引物在66個玉米自交系中共檢測出155個條帶，其中多態(tài)性條帶占100%，平均多態(tài)性信息量為0.721，說明供試材料間有一定的遺傳差異.確定10對SSR引物作為核心引物構建了重慶66份玉米自交系的指紋圖譜.這10對引物的擴增條帶均為3～4條，多數為3條，帶型統(tǒng)計簡單，可區(qū)分的最大自交系數N＝1.01×108，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝9.29×10－9，檢測66份自交系的DNA指紋圖譜沒有任何兩份帶型完全相同.證明利用這10對引物自交系的鑒定是可行有效的，可用于重慶地區(qū)玉米自交系鑒定.但篩選出的10對核心引物與譚君、李麗華、王偉、邱紅波、劉濤和蓋樹鵬等篩選的引物均存在差異，這可能與不同地區(qū)不同的玉米材料多態(tài)性存在差異有關.而關于如何確定最佳的引物組合，至今沒有統(tǒng)一的觀點，關于重慶地區(qū)玉米材料最佳的核心引物組合有待選取更多的自交系材料進行驗證，進一步篩選適合于重慶地區(qū)的最佳核心引物.

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