黃波，龍穎，李東陽

南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南省衡陽南華大學 421001

吸煙與健康

茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣遺傳毒性的防護作用

黃波，龍穎，李東陽

南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南省衡陽南華大學 421001

目的 研究卷煙煙氣所致人支氣管上皮細胞DNA損傷以及茶多酚二甲基亞砜合劑的保護作用，為卷煙煙氣對機體損傷的防護提供理論及實驗依據(jù)。方法 將細胞分為5組：空白組、卷煙煙氣組、茶多酚保護組、二甲基亞砜保護組、茶多酚二甲基亞砜合劑保護組；通過檢測微核和多核細胞觀察染色體損傷，彗星實驗及H2AX蛋白磷酸化檢測DNA的損傷，多核細胞法檢測細胞HPRT突變。結(jié)果 BEAS-2B細胞經(jīng)卷煙煙氣染毒后，細胞的微核率、多核率、拖尾率升高，H2AX蛋白磷酸化表達增高，HPRT突變率增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），茶多酚保護組、二甲基亞砜保護組能降低卷煙煙氣誘發(fā)的DNA損傷，合劑保護組的防護作用最好。結(jié)論 卷煙煙氣對BEAS-2B細胞DNA具有損傷作用，茶多酚二甲基亞砜合劑有較強防護作用。

卷煙煙氣；茶多酚；二甲基亞砜；DNA損傷；防護作用

研究表明，肺癌的死亡率與煙草的消費呈顯著正相關(guān)[1]。因此煙草被認為是人類致癌物質(zhì)，自由基是卷煙煙氣中主要的一類有害物質(zhì)，能導致人體組織和細胞的氧化，損害細胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，引發(fā)細胞病變、癌癥等疾病[2-4]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣抽提物（cigarette smoke condensates ，CSCs）染毒人支氣管細胞(human bronchial epithelial cells line，BEAS-2B)后，導致細胞產(chǎn)生大量自由基，隨CSCs染毒劑量而增高，細胞膜破裂，表現(xiàn)為細胞外的細胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶增高，細胞的DNA出現(xiàn)斷裂，微核細胞增多，基因突變率增高，表明卷煙煙氣通過誘發(fā)細胞自由基的大量產(chǎn)生，造成細胞的氧化損傷而引起遺傳毒性。在采用卷煙煙氣染毒時，加入茶多酚(tea polyphenols，TPs)，可使卷煙煙氣誘發(fā)人支氣管上皮細胞產(chǎn)生的自由基降低，細胞氧化損傷降低，能在一定程度減少從卷煙煙氣的危害。前期的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，二甲基亞砜(DMSO)對卷煙煙氣導致的人支氣管上皮細胞遺傳物質(zhì)損傷、自由基增多、基因位點突變有較好的防護作用。發(fā)現(xiàn)DMSO對卷煙煙氣作用于BEAS-2B細胞后，可引起彗星實驗中彗星細胞增多，DNA損傷加重，具有一定程度的抑制作用，表明二甲基亞砜、茶多酚均能一定程度上降低卷煙煙氣的氧化損傷[5-6]。

為更好地降低卷煙的危害，本實驗通過采用茶多酚和二甲基亞砜的合劑，采用人支氣管上皮細胞系（BEAS-2B細胞）作為靶細胞，驗證對卷煙煙氣抽提物所致遺傳毒性的防護作用，為控制卷煙煙氣危害及開發(fā)相關(guān)新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管上皮細胞（ BEAS-2B細胞）為軍事醫(yī)學科學院朱茂祥教授惠贈，以無血清培養(yǎng)基LHC-8培養(yǎng)，DMSO購自美國SIGMA公司，茶多酚（無錫太陽綠寶科技有限公司），卷煙煙氣抽提物（CSCs）：將標準參照卷煙（2R4F，肯塔基大學，美國），通過JJD200型單通道吸煙機（鄭州煙草研究院）導入氣泡吸收管中的乙醇和細胞培養(yǎng)基（V/V= 1:1）收集抽提物，配制成1支煙/mL的卷煙煙氣抽提物儲備液，-80℃貯存?zhèn)溆肹5]。

1.2 細胞分組及處理

處于對數(shù)生長期的人支氣管上皮細胞分為5組：對照組(BEAS-2B)、卷煙煙氣組(CSCs)、茶多酚保護組（CSCs+TPs）、二甲基亞砜保護組（CSCs+DMSO）、茶多酚二甲基亞砜合劑保護組（CSCs+TPs+DMSO）。卷煙煙氣組細胞加入終濃度為0.01支/mL卷煙煙氣抽提物；茶多酚保護組加入終濃度為 250 mg/L茶多酚、二甲基亞砜保護組加入終濃度為0.5% 二甲基亞砜，茶多酚二甲基亞砜合劑保護組加入0.5%二甲基亞砜+250mg/L 茶多酚，3個保護組加入上述保護劑后在細胞培養(yǎng)中孵育2h后，再加入終濃度為 0.01支/mL卷煙煙氣抽提物，染毒24h。

1.3 微核多核細胞檢測

細胞染毒24h后，棄去培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗凈，消化細胞，離心，以固定液（甲醇:乙酸=3:1）重懸細胞固定 15 min，Giemsa染色后，在油鏡下觀察細胞，計數(shù)每1000個細胞中微核細胞數(shù)和多核細胞數(shù)。

1.4 中性單細胞凝膠電泳實驗（彗星實驗）

實驗分組與染毒同上，染毒24h后，收集細胞制成懸液；收取細胞，并進行計數(shù)；將50-80μL 1%標準熔點瓊脂糖滴在預熱70-80℃毛玻璃載玻片上，以蓋玻片壓平膠液，放于4℃，冷卻至膠液凝結(jié)；將計數(shù)后的細胞按照1:5的比例與低熔點的瓊脂糖混勻，大約加入5000個細胞以蓋玻片壓平膠液，放于4℃，冷卻至膠液凝結(jié)；以100μl低熔點的瓊脂糖制作上層膠，冷卻至膠液凝結(jié)；去除蓋玻片，將膠塊浸泡在4℃的中性細胞裂解液中，避光，90-120min，以Tris-硼酸（終濃度為0.5%，pH：8.2-8.5）浸泡膠塊清洗殘余的裂解液60min，重復3次；水平電泳槽中放入玻片，加入中性緩沖液蓋過膠塊3-5毫米左右，以25-30V于4℃冰箱中電泳30分鐘，保持電流為5mA，取出玻片放于無Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，每片載玻片上加1.5μg/mL 的碘化丙錠，避光染色10min，400倍光鏡下計數(shù)彗星細胞并拍照觀察并拍照（奧林巴斯熒光顯微鏡顯）；彗星細胞用casp.exe軟件分析尾部DNA%、尾長。

1.5 磷酸化 H2AX蛋白表達檢測（Western Blot）

5組細胞處理完畢后，收集細胞團塊，加入蛋白裂解液，收集蛋白。用β-actin作為內(nèi)參，具體步驟如下：

將提取的5組細胞蛋白按100μg總蛋白量上樣，15%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳到標記的溴酚蘭至玻璃板的底部2h后停止電泳；以半干轉(zhuǎn)膜儀80V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜膜3h，TBST洗膜5分鐘×3；以10%的TBST奶粉封閉液浸泡纖維膜，在生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，或4℃過夜；室溫TBST洗膜5分鐘；根據(jù)NC膜上的蛋白分子量標記將膜分為兩半，一半檢測β-actin蛋白，下一部分用于H2AX蛋白，將NC膜放入含β-actin抗體和H2AX抗體的緩沖液中（1:1000），生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，或4℃過夜；室溫TBST洗膜3次，每次5分鐘；根據(jù)β-actin抗體和H2AX抗體的屬性，分別用對應的二抗TBST緩沖液（1: 1,000），生化培養(yǎng)箱中保溫孵育1h，洗去二抗TBST緩沖液；避光顯色檢測兩種細胞中β-actin蛋白和H2AX蛋白表達。

1.6 HPRT基因突變檢測[7]

細胞分別處理后，棄去原有的培養(yǎng)液，換新鮮的培養(yǎng)液，傳代5次后，分為兩部分，一部分在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1mmol/L 6-巰基鳥嘌呤，另一部分常規(guī)培養(yǎng)，兩部分細胞繼續(xù)培養(yǎng)30 h后，均加入終濃度為6μg/mL的細胞松弛素B，37℃培養(yǎng)42 h；終止培養(yǎng)后，消化離心，制成單個細胞懸液，固定液（醋酸:甲醇 =1:3）室溫15min；滴片干燥，吉姆薩染色15-20min，清洗，光學顯微鏡鏡（1000倍）觀察5000個細胞，記錄在同一胞漿內(nèi)具有完整核膜的雙核或多核細胞（包括相壓、相切和分離的雙核或多核細胞數(shù)）。以6-TG培養(yǎng)的每1000個細胞中的多核或雙核細胞數(shù)和常規(guī)培養(yǎng)的每1000個細胞中雙核或多核細胞數(shù)之比，為HPRT基因位點發(fā)生突變的頻率（‰）。

1.7 數(shù)據(jù)處理分析

用SPSS 13.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用χ－±s 表示。保護組與對照組、保護組與卷煙煙氣組間的比較采用卡方檢驗進行分析。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卷煙煙氣致細胞微核多核發(fā)生的影響及茶多酚二甲基亞砜合劑的防護作用

0.01支/mL卷煙煙氣能導致人支氣管上皮細胞的多核細胞及微核細胞發(fā)生率增高（與對照組比較，P＜0.05），表明具有較明顯的遺傳毒性。3個保護組對誘發(fā)微核率及多核率增高有明顯的抑制作用（與煙氣組比較，P＜0.05），在3個保護組中，茶多酚二甲基亞砜合劑保護組的防護作用較二甲基亞砜、茶多酚單獨使用更為顯著（P＜0.05）。

表1 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致微核多核細胞數(shù)增多的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 1 Multinucleated cells and micronucleus induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.2 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細胞拖尾數(shù)增多的抑制作用

在單細胞凝膠電泳中，可見卷煙煙氣染毒后可導致BEAS-2B細胞出現(xiàn)顯著的DNA損傷，表現(xiàn)為彗星細胞數(shù)、彗星尾部DNA百分比增加，彗星尾長變長，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3個保護組對卷煙煙氣誘發(fā)的細胞DNA的損傷具有有明顯的抑制作用，與卷煙煙氣組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在3個保護組中，茶多酚二甲基亞砜合劑保護組的防護作用較二甲基亞砜、茶多酚單獨使用更為顯著（P＜0.05）。

表2 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致DNA損傷的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 2 DNA damage induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

2.3 H2AX磷酸化檢測

由圖1可見，內(nèi)參β－actin蛋白表達量各組基本均一，表示各組細胞上樣量均一、準確。H2AX（Ser139）蛋白表達條帶中，光密度值由高到低是卷煙煙氣組、茶多酚組、二甲基亞砜組、茶多酚二甲基亞砜合劑保護組光密H2AX（Ser139）磷酸化程度表明卷煙煙氣導致BEAS-2B細胞顯著的DNA損傷；而3個保護組能具有抑制卷煙煙氣DNA損傷的能力，其中茶多酚二甲基亞砜合劑保護組的保護作用最強。

2.4 HPRT基因突變檢測

基因位點突變率檢測發(fā)現(xiàn)，卷煙煙氣可引起細胞HPRT基因突變率增高（P＜0.05）；3個保護組可抑制卷煙煙氣引起的突變率增高，均具有統(tǒng)計學意義。

圖1 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細胞Phospho-Histone H2AX表達增高的影響Fig. 1 Expression of Phospho-Histone H2AX induced by CSCs in BEAS-2B and the protective effect of TPs DMSO mixture

表3 茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣致細胞HPRT基因突變率增高的抑制作用(χ－±s，n=4)Tab. 3 HPRT mutation frequency induced by CSCs in BEAS-2B and protective effect of TPs DMSO mixture(χ－ ±s，n=4)

3 討論

卷煙煙氣中有150多種化學成分有明確毒理學資料顯示具有毒性，并被稱為煙草煙氣有害成分[8,9]。這部分化學成分具有較強的刺激性、致癌性和促癌性，可造成人體多器官多系統(tǒng)損傷，我們的研究也證明了這一點[5,6]。在我們的前期實驗中，觀察到卷煙煙氣可以導致自由基的大量產(chǎn)生，導致細胞的抗氧化酶系出現(xiàn)失衡，細胞出現(xiàn)氧化損傷，誘發(fā)遺傳毒性的產(chǎn)生，而茶多酚能夠在一定程度上抑制卷煙煙氣的危害[5]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，人支氣管上皮細胞經(jīng)卷煙煙氣染毒后導致的細胞出現(xiàn)大量的微核多核細胞，彗星細胞增多，磷酸化H2AX蛋白高表達，HPRT突變率增高，表明卷煙煙氣具有較強的遺傳毒性，各保護組均能有效抑制卷煙煙氣的DNA損傷，其中茶多酚與二甲基亞砜配合后的防護效果好于兩者單獨使用。說明茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣引起的DNA和染色體損傷具有較強的保護作用。

基因突變可導致癌癥的發(fā)生，所以檢測敏感基因位點的突變率，是一種有效預測癌癥發(fā)生的有效手段，HPRT基因就符合我們的需要，它的突變可受多種環(huán)境因素的影響，在多種人類腫瘤細胞中，可以發(fā)現(xiàn)HPRT突變頻率比功能正常的腫瘤細胞高50-750倍[10]。

在多種檢測DNA損傷的手段中，γ-H2AX的形成意味著DNA雙鏈的斷裂，是一個快速敏感的細胞反應，而且γ-H2AX表達高低是和外源性因素的劑量、強度、持續(xù)時間成正相關(guān)的，當DNA出現(xiàn)雙鏈斷裂時，可以通過γ-H2AX的表達量來檢測DNA受損的嚴重程度[11,12]，是一個有效檢測DNA損傷的生物標志物。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，茶多酚與二甲基亞砜配合后的防護效果好于兩者單獨使用。由于生物機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生是一個多步驟，網(wǎng)絡式的產(chǎn)生過程。單獨使用一種自由基清除劑，僅能對其中一個步驟或節(jié)點產(chǎn)生作用，效率不高。如果能用多種性質(zhì)不同、針對不同自由基產(chǎn)生節(jié)點的自由基清除劑組成復合自由基清除劑將會產(chǎn)生更好的效果，達到高效防護自由基的損傷作用。近年來，國內(nèi)外專家分別提出了“抗氧化復合鏈”和“抗氧化網(wǎng)絡”等概念，已逐漸成為抗氧化劑研究的一個熱點[13]。多種性質(zhì)自由基清除劑構(gòu)成的抗氧化劑網(wǎng)絡，由于彼此之間的協(xié)同作用，而使其自由基清除能力被放大，還可顯著提高彼此的活性。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)雖然茶多酚及二甲基亞砜單獨使用對自由基的去除有一定的效果，但未達到理想的結(jié)果。所以，我們以上述理論為指導，采用性質(zhì)不同的自由基防護劑茶多酚、二甲基亞砜聯(lián)合作用，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)達到了很好的防護效果，比單一使用效果更佳。這為卷煙的減害研究提供了新的思路。

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Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke

HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang
School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, Hunan, China

Cigarette smoke condensates（CSC）induced DNA damage in BEAS-2B cells and protective effect of tea polyphenols DMSO mixture were studied with an objective to offer theoretical and experimental basis for protection against CSC-induced damage. BEAS-2B cells were divided into 5 groups, i.e. control, CSC, tea polyphenol protection, DMSO protection and TPs DMSO mixture protection.Chromosomal damage was determined by measuring the frequency of micronuclei and multinucleated cells. DNA damage was examined by comet assay and level of γH2AX. Gene mutation was detected by HPRT gene mutation assay. Results showed that after BEAS-2 B cells were exposed to CSC, frequency of micronuclei and multinucleated cells, tail length, expression of H2AX protein phosphorylation and mutation rate of HPRT were all increased signi fi cantly (P ＜ 0.05). Three protection groups effectively reduced these changes and tea polyphenol DMSO mixture protection group was proved the best group. It was concluded that CSC can cause DNA damage of BEAS-2 B cells and tea polyphenols DMSO mixture has a strong protective effect.

CSC; BEAS-2 B cells; tea polyphenols DMSO mixture; DNA damage; protective effect

:HUANG Bo, LONG Ying, LI Dongyang. Protective effects of TPs DMSO mixture against genotoxicity of cigarette smoke [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)

黃波，龍穎，李東陽.茶多酚二甲基亞砜合劑對卷煙煙氣遺傳毒性的防護作用[J]. 中國煙草學報，2015,21（2）

國家自然科學基金資助(No. 81272994)

黃波（1974—），副教授，博士，研究方向為環(huán)境化學致癌及其醫(yī)學防護，Email: huangbo0930@163.com

2014-04-16