蔣志強　郝長城

[摘 要] 目的：研究HMGN5基因mRNA在肺癌組織中表達(dá)。方法：選取80例肺癌患者與80例非肺癌患者（對照組）的肺組織標(biāo)本，測定其HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平進(jìn)行比較，并分析不同病理類型和臨床分期之間的HMGN5mRNA含量差異。結(jié)果：肺癌組標(biāo)本中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平顯著高于對照組（P<0.05）；各病理分型肺癌組織中HMGN5的mRNA含量間沒有顯著性差（P>0.05）；TNM分期Ⅰ期II期的肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期（P<0.05）。結(jié)論：HMGN5在肺癌組織中的表達(dá)顯著增高，且臨床分期提高，基因表達(dá)水平提高，提示HMGN5與肺癌的發(fā)生和發(fā)展可能存在關(guān)聯(lián)。

[關(guān)鍵詞] HMGN5；肺癌；mRNA水平；相關(guān)性研究

中圖分類號：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2015）02-058-03

DOI：10.11876/mimt201502022

肺癌是危害人類健康惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肝癌，非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌80%，其5年總生存率僅為15%左右 [1]。隨著分子生物學(xué)水平研究開展，分子診斷技術(shù)作為組織病理學(xué)和影像學(xué)檢查補充策略，不僅可輔助肺癌早期診斷，還能協(xié)助判斷其發(fā)展趨勢、判斷預(yù)后，為分子靶向治療提供依據(jù)[2]。高遷移率族（high mobility group，HMG）蛋白是在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有較高遷移速率蛋白家族，包括：HMGA、HMGB和和HMGN。HMGN是一類與核小體結(jié)合核蛋白，其作用是調(diào)整染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而增強其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[3]。HMGN5又稱核小體結(jié)合蛋白1（NSBP1），僅在特定組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其在胞質(zhì)內(nèi)定位和含量高低與細(xì)胞增殖周期有關(guān)，而肺癌中惡性增殖細(xì)胞周期調(diào)控機制異常。本研究通過實時熒光定量PCR方法測定肺癌組織中HMGN5基因mRNA水平，探討其對肺癌發(fā)生和發(fā)展影響，為肺癌診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年10月至2013年10月我院確診80例肺癌患者（肺癌組）以及同期疑為肺組織惡變但病理檢查陰性80例非肺癌患者（對照組）為研究對象。肺癌組：男54例，女26例；年齡42～81歲，平均（56.8±7.6）歲；組織病理分型：腺癌24例，鱗癌54例，大細(xì)胞癌2例；TNM分期：Ⅰ期9例， Ⅱ期15例， Ⅲa期16例， Ⅲb期19例， Ⅳ期21例；無轉(zhuǎn)移者34例，有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者15例。對照組：男42例，女38例；年齡33～76歲，平均（53.5±9.6）歲；疾病類型：肺部感染27例，慢性支氣管炎24例，肺氣腫16例，肺結(jié)核10例，肺纖維瘤2例，縱膈腫瘤1例。對照組患者經(jīng)臨床或組織病理檢查證實肺組織無惡變且排除有肺癌家族史者。

1.2 方法

提取RNA： 取直徑約4mm組織研磨，離心后去上清，加入1mL Trizol，靜置10min后加300μL氯仿抽提；離心后取上清用異丙醇沉淀10min，離心后取沉淀；使用75%乙醇洗滌沉淀，離心取沉淀，室溫干燥；加入RNA-free去離子水溶解沉淀，測定OD260：OD280，計算RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄PCR：取RNA2μg ，依次加入1μL Oligo （dT）、DEPC水，混勻后離心，70℃變性10min后立即放入0℃冰水中冰浴5min，計算出M-MLV以及底物量，將底物、引物和酶與逆轉(zhuǎn)錄液混勻，設(shè)置好PCR參數(shù)，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于Real-time PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性2min，然后95℃15s～60℃1min循環(huán)45次，最后95℃變性1min后冷卻至55℃，讀取Ct值，計算出RNA相對表達(dá)量。

1.3 評價指標(biāo)

每個標(biāo)本讀取兩次循環(huán)閾值（Ct值）后取平均值，ΔCt值以標(biāo)本中HMGN5基因Ct值減去對照組基因Ct值，ΔΔCt為肺癌組織HMGN5基因ΔCt值減正常組織HMGN5基因ΔCt值。以2-ΔΔCt表示肺癌組織中HMGN5基因相對含量，當(dāng)2-ΔΔCt>2認(rèn)為該基因表達(dá)水平高。比較肺癌組和對照組病理組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平（以2-ΔΔCt表示）。比較不同病理類型、不同臨床分期肺癌組織中HMGN5轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)值變量資料用x±s表示，組間采用配對樣本資料t檢驗；無序分類變量資料用n%表示，采用獨立樣本R×C列聯(lián)表資料χ2檢驗。均以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組和對照組mRNA水平

肺癌組患者標(biāo)本中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），數(shù)據(jù)見表1。

2.2 病理類型及分期與mRNA水平

對各病理類型肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA含量進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）數(shù)據(jù)見表2。

TNM分期Ⅰ期肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期，差異有顯著性（P<0.05）。Ⅱ期肺癌組織中雖然ΔCt 明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期，但2-ΔΔCt 經(jīng)t檢驗分析差異統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

肺癌發(fā)生發(fā)展生物學(xué)過程十分復(fù)雜，目前其分子機制研究發(fā)現(xiàn)肺癌發(fā)生主要與原癌基因激活和抑癌基因抑制相關(guān)，隨著研究進(jìn)一步深入，其他與肺癌相關(guān)基因作用和機制也得到一定闡述[4]。HMG蛋白是動物細(xì)胞核內(nèi)除組蛋白外含量最豐富蛋白質(zhì)之一，HMGN通過與核小體動態(tài)結(jié)合從部分或總體上對細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，已有不少報道稱這一作用可能對腫瘤發(fā)生及發(fā)展有相關(guān)影響[5]。

HMGN5即NSBP1，其基因全長為8600bp ，由6個外顯子、5個內(nèi)顯子及非編碼區(qū)構(gòu)成，其cDNA序列全長1865 bp [6]。HMGN5結(jié)構(gòu)特點對其生物學(xué)作用有著重要意義，其正確空間結(jié)構(gòu)是與連接體組蛋白H1競爭結(jié)合核小體基礎(chǔ)，可減弱后者對核小體穩(wěn)定作用從而使染色體結(jié)構(gòu)快速解聚。HMGN家族因分子質(zhì)量小具有高度流動性，在沿著細(xì)胞核持續(xù)流動過程中隨機地與核小體結(jié)合，與之結(jié)合成復(fù)合體后，高度有序染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性被降低，從而影響DNA轉(zhuǎn)錄和修復(fù)[7]。

HMGN5 蛋白分布具有一定組織器官特異性并且隨個體生長發(fā)育發(fā)生改變，在幼兒腦和肺組織中并未檢測出其表達(dá)，但在成人肝、腎、胰腺及骨髓中均有一定水平表達(dá)。雖然HMGN5作用具體分子機制尚未完全得到證實，但已有學(xué)者報道HMGN5蛋白在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等組織中表達(dá)水平增高，HMG基因重排、斷裂與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤以及脂肪瘤等腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]。研究報道[9]稱抑制HMGN5表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞活性降低，且G2/M+S期細(xì)胞數(shù)目明顯下降，這一過程可能與HMGN5參與cyclinB1等細(xì)胞周期蛋白調(diào)控有關(guān)，但目前關(guān)于HMGN5基因在肺癌中作用相關(guān)報道還比較少。

本次研究結(jié)果表明肺癌細(xì)胞中HMGN5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高（P<0.05）；肺癌臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期者組織中HMGN5基因表達(dá)水平較早期顯著升高（P<0.05），但不同病理分型肺癌組織中HMGN5mRNA含量間沒有顯著性差（P>0.05）。陳鵬等 [10]使用反義RNA干擾mRNA表達(dá)，通過構(gòu)建小干擾RNA（siRNA）慢病毒表達(dá)載體沉默HMGN5基因，結(jié)果顯示被慢病毒感染后細(xì)胞HMGN5mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，被感染細(xì)胞細(xì)胞周期中在G0進(jìn)入G1期時發(fā)生阻滯，提示HMGN5沉默可顯著抑制肺癌細(xì)胞分裂增殖，因而認(rèn)為HMGN5表達(dá)參與了惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。閻紅娥等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中HMGN5陽性率較癌旁組織明顯升高，而且其在細(xì)胞中定位與細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝和增殖關(guān)鍵部位相關(guān)，該實驗還發(fā)現(xiàn)隨著肺癌進(jìn)展，HMGN5表達(dá)逐漸呈增高趨勢，與本次研究結(jié)果相似。作者認(rèn)為HMGN5主要通過縮短細(xì)胞周期，加速癌細(xì)胞分裂增殖從而促進(jìn)肺癌發(fā)展。

綜上所述，HMGN5基因在肺癌組織中有較高轉(zhuǎn)錄水平，且隨著疾病進(jìn)展，其表達(dá)水平逐漸升高，為肺癌分子靶向治療提供了新思路，可能成為抗肺癌分子治療策略作用新靶點。

參 考 文 獻(xiàn)

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