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        實時熒光PCR檢測HMGN5基因mRNA在肺癌組織中水平及臨床價值

        2015-12-03 10:18:31蔣志強郝長城
        現(xiàn)代儀器與醫(yī)療 2015年2期
        關(guān)鍵詞:相關(guān)性研究肺癌

        蔣志強 郝長城

        [摘 要] 目的:研究HMGN5基因mRNA在肺癌組織中表達(dá)。方法:選取80例肺癌患者與80例非肺癌患者(對照組)的肺組織標(biāo)本,測定其HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平進(jìn)行比較,并分析不同病理類型和臨床分期之間的HMGN5mRNA含量差異。結(jié)果:肺癌組標(biāo)本中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05);各病理分型肺癌組織中HMGN5的mRNA含量間沒有顯著性差(P>0.05);TNM分期Ⅰ期II期的肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄的mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期(P<0.05)。結(jié)論:HMGN5在肺癌組織中的表達(dá)顯著增高,且臨床分期提高,基因表達(dá)水平提高,提示HMGN5與肺癌的發(fā)生和發(fā)展可能存在關(guān)聯(lián)。

        [關(guān)鍵詞] HMGN5;肺癌;mRNA水平;相關(guān)性研究

        中圖分類號:R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:2095-5200(2015)02-058-03

        DOI:10.11876/mimt201502022

        肺癌是危害人類健康惡性腫瘤之一,其死亡率僅次于肝癌,非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌80%,其5年總生存率僅為15%左右 [1]。隨著分子生物學(xué)水平研究開展,分子診斷技術(shù)作為組織病理學(xué)和影像學(xué)檢查補充策略,不僅可輔助肺癌早期診斷,還能協(xié)助判斷其發(fā)展趨勢、判斷預(yù)后,為分子靶向治療提供依據(jù)[2]。高遷移率族(high mobility group,HMG)蛋白是在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有較高遷移速率蛋白家族,包括:HMGA、HMGB和和HMGN。HMGN是一類與核小體結(jié)合核蛋白,其作用是調(diào)整染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而增強其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[3]。HMGN5又稱核小體結(jié)合蛋白1(NSBP1),僅在特定組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá),其在胞質(zhì)內(nèi)定位和含量高低與細(xì)胞增殖周期有關(guān),而肺癌中惡性增殖細(xì)胞周期調(diào)控機制異常。本研究通過實時熒光定量PCR方法測定肺癌組織中HMGN5基因mRNA水平,探討其對肺癌發(fā)生和發(fā)展影響,為肺癌診斷和治療提供參考。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選擇2012年10月至2013年10月我院確診80例肺癌患者(肺癌組)以及同期疑為肺組織惡變但病理檢查陰性80例非肺癌患者(對照組)為研究對象。肺癌組:男54例,女26例;年齡42~81歲,平均(56.8±7.6)歲;組織病理分型:腺癌24例,鱗癌54例,大細(xì)胞癌2例;TNM分期:Ⅰ期9例, Ⅱ期15例, Ⅲa期16例, Ⅲb期19例, Ⅳ期21例;無轉(zhuǎn)移者34例,有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例,有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者15例。對照組:男42例,女38例;年齡33~76歲,平均(53.5±9.6)歲;疾病類型:肺部感染27例,慢性支氣管炎24例,肺氣腫16例,肺結(jié)核10例,肺纖維瘤2例,縱膈腫瘤1例。對照組患者經(jīng)臨床或組織病理檢查證實肺組織無惡變且排除有肺癌家族史者。

        1.2 方法

        提取RNA: 取直徑約4mm組織研磨,離心后去上清,加入1mL Trizol,靜置10min后加300μL氯仿抽提;離心后取上清用異丙醇沉淀10min,離心后取沉淀;使用75%乙醇洗滌沉淀,離心取沉淀,室溫干燥;加入RNA-free去離子水溶解沉淀,測定OD260:OD280,計算RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄PCR:取RNA2μg ,依次加入1μL Oligo (dT)、DEPC水,混勻后離心,70℃變性10min后立即放入0℃冰水中冰浴5min,計算出M-MLV以及底物量,將底物、引物和酶與逆轉(zhuǎn)錄液混勻,設(shè)置好PCR參數(shù),逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于Real-time PCR反應(yīng):95℃預(yù)變性2min,然后95℃15s~60℃1min循環(huán)45次,最后95℃變性1min后冷卻至55℃,讀取Ct值,計算出RNA相對表達(dá)量。

        1.3 評價指標(biāo)

        每個標(biāo)本讀取兩次循環(huán)閾值(Ct值)后取平均值,ΔCt值以標(biāo)本中HMGN5基因Ct值減去對照組基因Ct值,ΔΔCt為肺癌組織HMGN5基因ΔCt值減正常組織HMGN5基因ΔCt值。以2-ΔΔCt表示肺癌組織中HMGN5基因相對含量,當(dāng)2-ΔΔCt>2認(rèn)為該基因表達(dá)水平高。比較肺癌組和對照組病理組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平(以2-ΔΔCt表示)。比較不同病理類型、不同臨床分期肺癌組織中HMGN5轉(zhuǎn)錄水平。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)值變量資料用x±s表示,組間采用配對樣本資料t檢驗;無序分類變量資料用n%表示,采用獨立樣本R×C列聯(lián)表資料χ2檢驗。均以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 肺癌組和對照組mRNA水平

        肺癌組患者標(biāo)本中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),數(shù)據(jù)見表1。

        2.2 病理類型及分期與mRNA水平

        對各病理類型肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA含量進(jìn)行兩兩比較,經(jīng)檢驗,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)數(shù)據(jù)見表2。

        TNM分期Ⅰ期肺癌組織中HMGN5基因轉(zhuǎn)錄mRNA含量明顯低于Ⅲ期和Ⅳ期,差異有顯著性(P<0.05)。Ⅱ期肺癌組織中雖然ΔCt 明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期,但2-ΔΔCt 經(jīng)t檢驗分析差異統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        3 討論

        肺癌發(fā)生發(fā)展生物學(xué)過程十分復(fù)雜,目前其分子機制研究發(fā)現(xiàn)肺癌發(fā)生主要與原癌基因激活和抑癌基因抑制相關(guān),隨著研究進(jìn)一步深入,其他與肺癌相關(guān)基因作用和機制也得到一定闡述[4]。HMG蛋白是動物細(xì)胞核內(nèi)除組蛋白外含量最豐富蛋白質(zhì)之一,HMGN通過與核小體動態(tài)結(jié)合從部分或總體上對細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,已有不少報道稱這一作用可能對腫瘤發(fā)生及發(fā)展有相關(guān)影響[5]。

        HMGN5即NSBP1,其基因全長為8600bp ,由6個外顯子、5個內(nèi)顯子及非編碼區(qū)構(gòu)成,其cDNA序列全長1865 bp [6]。HMGN5結(jié)構(gòu)特點對其生物學(xué)作用有著重要意義,其正確空間結(jié)構(gòu)是與連接體組蛋白H1競爭結(jié)合核小體基礎(chǔ),可減弱后者對核小體穩(wěn)定作用從而使染色體結(jié)構(gòu)快速解聚。HMGN家族因分子質(zhì)量小具有高度流動性,在沿著細(xì)胞核持續(xù)流動過程中隨機地與核小體結(jié)合,與之結(jié)合成復(fù)合體后,高度有序染色體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性被降低,從而影響DNA轉(zhuǎn)錄和修復(fù)[7]。

        HMGN5 蛋白分布具有一定組織器官特異性并且隨個體生長發(fā)育發(fā)生改變,在幼兒腦和肺組織中并未檢測出其表達(dá),但在成人肝、腎、胰腺及骨髓中均有一定水平表達(dá)。雖然HMGN5作用具體分子機制尚未完全得到證實,但已有學(xué)者報道HMGN5蛋白在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等組織中表達(dá)水平增高,HMG基因重排、斷裂與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤以及脂肪瘤等腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]。研究報道[9]稱抑制HMGN5表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞活性降低,且G2/M+S期細(xì)胞數(shù)目明顯下降,這一過程可能與HMGN5參與cyclinB1等細(xì)胞周期蛋白調(diào)控有關(guān),但目前關(guān)于HMGN5基因在肺癌中作用相關(guān)報道還比較少。

        本次研究結(jié)果表明肺癌細(xì)胞中HMGN5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高(P<0.05);肺癌臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期者組織中HMGN5基因表達(dá)水平較早期顯著升高(P<0.05),但不同病理分型肺癌組織中HMGN5mRNA含量間沒有顯著性差(P>0.05)。陳鵬等 [10]使用反義RNA干擾mRNA表達(dá),通過構(gòu)建小干擾RNA(siRNA)慢病毒表達(dá)載體沉默HMGN5基因,結(jié)果顯示被慢病毒感染后細(xì)胞HMGN5mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,被感染細(xì)胞細(xì)胞周期中在G0進(jìn)入G1期時發(fā)生阻滯,提示HMGN5沉默可顯著抑制肺癌細(xì)胞分裂增殖,因而認(rèn)為HMGN5表達(dá)參與了惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。閻紅娥等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中HMGN5陽性率較癌旁組織明顯升高,而且其在細(xì)胞中定位與細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝和增殖關(guān)鍵部位相關(guān),該實驗還發(fā)現(xiàn)隨著肺癌進(jìn)展,HMGN5表達(dá)逐漸呈增高趨勢,與本次研究結(jié)果相似。作者認(rèn)為HMGN5主要通過縮短細(xì)胞周期,加速癌細(xì)胞分裂增殖從而促進(jìn)肺癌發(fā)展。

        綜上所述,HMGN5基因在肺癌組織中有較高轉(zhuǎn)錄水平,且隨著疾病進(jìn)展,其表達(dá)水平逐漸升高,為肺癌分子靶向治療提供了新思路,可能成為抗肺癌分子治療策略作用新靶點。

        參 考 文 獻(xiàn)

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