袁浩鋒??何科??汪中揚??瞿虎??張靖??馬波

[摘要] 目的 通過體外研究觀察不同濃度鹽霉素及其聯(lián)合應用紫衫醇、絲裂霉素對膀胱移行細胞癌T24細胞增殖活性的抑制作用。 方法 將鹽霉素（SAL）單藥分別配成鹽霉素0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mg/mL培養(yǎng)液并分不同濃度處理組；鹽霉素（SAL）聯(lián)合紫杉醇（PAC）聯(lián)合用藥處理：使用細胞培養(yǎng)液配成五種不同濃度，以PAC 0.5μg/mL為陽性對照組；鹽霉素（SAL）聯(lián)合絲裂霉素（MMC）聯(lián)合用藥處理五種濃度，并以MMC 2.0μg/mL為陽性對照組；各組均設空白及陰性對照。分別于藥物處理24h（或48h）及48h（或72h）后通過CCK8法測定吸光度，并計算細胞生長抑制率及相對細胞生長抑制率。 結果 不同濃度鹽霉素單獨用藥后對細胞的生長出現(xiàn)增殖活性均有抑制作用；不同濃度鹽霉素聯(lián)合紫杉醇對增殖活性明顯的抑制作用，且具有一定的時間依賴性。鹽霉素聯(lián)合絲裂霉素對膀胱移行細胞癌T24細胞的體外增殖活性有顯著抑制作用。 結論 不同濃度鹽霉素單用及聯(lián)合應用紫杉醇或絲裂霉素均對T24細胞增殖活性有抑制作用，并且與濃度和時間一定的依賴性。

[關鍵詞] 鹽霉素；膀胱癌；T24細胞；紫杉醇；絲裂霉素

[中圖分類號] R737.14 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-27-05

In vitro inhibition effect of single medication and combined medication of salinomycin on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferation

YUAN Haofeng1 HE Ke2 WANG Zhongyang3 QU Hu3 ZHANG Jing3 MA Bo3

1.Department of Urinary Surgery， Dongguan Third People's Hospital， Dongguan 523326， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， First Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou 510080， China； 3.Department of Urinary Surgery， Sixth Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou 510080， China

[Abstract] Objective To observe inhibition effect of various concentration of salinomycin combined with paclitaxel or with mitomycin on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferative activity in vitro study. Methods Culture medium with 0.1mg/mL， 0.2mg/mL， 0.4mg/mL， 0.8mg/mL and 1.6mg/mL of salinomycin were respectively prepared and they were allocated to different concentration treatment group. Combined medication of SAL with paclitaxel （PAC） included that cell culture medium was prepared into five different concentration and positive PAC 0.5μg/mL was set as the control group. Combined medication of SAL with mitomycin （MMC） was prepared into five different concentration and positive MMC 2.0μg/mL set as the control group. Each group had bank control and positive control. Absorbance of 24 hours （or 48 hours） and 48 hours （or 72 hours） after medicament treatment was detected by CCK8 method. In addition， cell growth inhibition rate and relative cell growth inhibition rate were calculated. Results Different concentration of SAL had different inhibition effects on cell proliferative activity. Different concentration of SAL combined with PAC had obvious inhibition effect on cell proliferative activity and it had time-dependent manner. SAL combined with MMC had significant in vitro inhibition effect on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferative activity. Conclusion Single mediation of SAL or different concentration of SAL combined with PAC or MMC all had inhibition effect on T24 cell proliferative activity and it is dependent on concentration and time to some degree.

[Key words] SAL； Bladder cancer； T24 cell； PAC； MMC

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，

在60歲以后其發(fā)病率甚至超過腎腫瘤居國內(nèi)泌尿系惡性腫瘤發(fā)病第1位，占惡性腫瘤發(fā)病構成的2.5%，且總體發(fā)病率仍呈不斷增長趨勢[1]，具有高復發(fā)率和進展率的特點，發(fā)達國家中膀胱癌已成為最沉重的醫(yī)療負擔[2]，如何尋找行之有效的治療手段已成為臨床急需解決的實際問題。Gupta等（2009）[3]發(fā)現(xiàn)鹽霉素能抑制乳腺癌干細胞形成腫瘤微球體，并抑制乳腺癌胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移能力并逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多重耐藥性的能力。此后大量研究表明鹽霉素對白血病、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤細胞均有抗殺傷作用[4-6]，但此種作用在鹽霉素對人膀胱移行細胞癌T24細胞方面的研究匱乏。本實驗即通過體外研究觀察不同濃度的鹽霉素及其聯(lián)合紫衫醇、絲裂霉素對膀胱移行細胞癌T24細胞增殖活性的抑制作用，探索臨床實際對于膀胱癌治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽霉素標準品購自上海伊卡生物技術有限公司，紫衫醇購自上海金穗生物科技有限公司，絲裂霉素（浙江海正藥業(yè)股份公司，H33020786），RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自廣州義邦生物有限公司。人膀胱癌T24細胞來自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由中山大學附屬第二醫(yī)院保存及提供，傳至第3代。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

細胞培養(yǎng)液的配置以10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基混合而成；T24細胞置于條件37℃恒溫培養(yǎng)箱2～3d傳代一次。

1.3 藥物配置及分組

鹽霉素（SAL）單藥處理：在細胞培養(yǎng)液中加入鹽霉素，配成鹽霉素0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mg/mL培養(yǎng)液并分不同濃度處理組；鹽霉素（SAL）聯(lián)合紫杉醇（PAC）聯(lián)合用藥處理：使用細胞培養(yǎng)液配成PAC 0.5、PAC 0.5+SAL 10、PAC 0.5+SAL 40、PAC 0.5+SAL 160、PAC 0.5+SAL 640μg/mL五種濃度（其中每組中PAC濃度為0.5μg/mL）， PAC 0.5μg/mL為陽性對照組，；鹽霉素（SAL）聯(lián)合絲裂霉素（MMC）聯(lián)合用藥處理：使用細胞培養(yǎng)液配成MMC 2.0、MMC 2.0+SAL 10、MMC 2.0 +SAL 40、MMC 2.0+SAL 160、MMC 2.0+SAL 640μg/mL五種濃度（其中每組中MMC濃度為2.0μg/mL），以MMC 2.0μg/mL為陽性對照組；各組均設空白及陰性對照。

1.4 細胞藥物處理及檢測

取對數(shù)生長期細胞以每孔100μL（約5×103細胞）接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，加入不同濃度藥物進行干預，并設以純培養(yǎng)液處理的陰性對照組及不含細胞純培養(yǎng)液的空白組，每組設5個復孔。分別于藥物處理24h（或48h）及48h（或72h）后通過CCK8法測定吸光度，并使用以下公式計算細胞生長抑制率及相對細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=[1-（處理組吸光度-空白組吸光度）/（陰性對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%；相對細胞生長抑制率（%）=[1-（處理組吸光度-空白組吸光度）/（陽性對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，使用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外研究鹽霉素單藥對膀胱移行細胞癌T24細胞增殖活性的抑制

對照組T24細胞增殖活躍，不同濃度鹽霉素單獨用藥后對細胞的生長出現(xiàn)增殖活性不同程度抑制作用，有濃度及時間依賴性。如表1所示，使用鹽霉素處理T24細胞于24h即顯示出增殖抑制，并且隨著藥物濃度增殖抑制作用更顯著，相同濃度下48h時間比24h更為明顯。除SAL 0.1mg/mL組外，其余各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 鹽霉素聯(lián)合紫杉醇對膀胱移行細胞癌T24細胞增殖活性的抑制

體外研究不同濃度鹽霉素聯(lián)合紫杉醇作用于膀胱移行細胞癌T24細胞均顯示對增殖活性明顯的抑制作用（P<0.05）。見表2。以PAC 0.5μg/mL為陽性對照組計算得相對抑制濃度，聯(lián)合用藥組比PAC 0.5μg/mL陽性對照組出現(xiàn)明顯濃度依賴性抑制作用，且除SAL10+PAC 0.5μg/mL組外，其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表3。紫衫醇聯(lián)合不同濃度鹽霉素的抑制作用具有明顯的鹽霉素濃度依賴性并一定的時間依賴性。

2.3 鹽霉素聯(lián)合絲裂霉素對人膀胱癌T24細胞增殖的抑制作用

不同濃度的鹽霉素聯(lián)合絲裂霉素對膀胱移行細胞癌T24細胞的體外增殖活性有顯著時間依賴性及一定程度的濃度依賴的抑制作用以MMC2.0μg/mL為陽性對照組，聯(lián)合用藥組比MMC 2.0μg/mL陽性對照組出現(xiàn)明顯濃度及時間依賴性抑制作用，并且除MMC2.0+SAL 10μg/mL組外，其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表4～5。

3 討論

鹽霉素早期主要是作為家禽的抗球蟲藥和反芻動物的生長促進劑來使用，其屬一元羧酸聚醚類離子載體動物用抗生素，具抗菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗瘧藥、抗病毒等廣泛的生物活性[7]。2009年Gupta等[3]在高通量篩選研究中發(fā)現(xiàn)其具有抑制乳腺癌胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移能力并逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多重耐藥性的能力。隨后研究表明鹽霉素對白血病、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤細胞均有抗殺傷作用[4-6]。