沈艷玲?王嬌??孫立元

[摘要] 目的 探討小鼠正常腦脊液鎂離子的濃度及血清鎂離子濃度改變后對(duì)它的影響。 方法 使用戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉動(dòng)物。在鼠尾尖端1～1.5cm處剪斷鼠尾，收集血液；剝離小鼠后頸部皮膚肌肉，暴露硬腦膜，使用蝶形針在枕大池內(nèi)吸取腦脊液；用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）檢測(cè)C57BL/6型（B6型）和ICR型小鼠正常腦脊液和血清鎂離子濃度，并檢測(cè)B6型小鼠腹腔注射硫酸鎂（1.23g/kg） 20min、40min、2h、4h后腦脊液和血清鎂離子濃度的改變。 結(jié)果 正常B6型小鼠腦脊液和血清鎂離子濃度分別是（0.89±0.11）mM和（1.38±0.12）mM。正常ICR型小鼠腦脊液和血清鎂離子濃度分別是（1.00±0.12）mM和（1.10±0.09）mM。B6型小鼠腹膜內(nèi)注射硫酸鎂后血清鎂離子濃度從（1.38±0.12）mM（正常水平）增加到（8.68 ± 1.85）mM（注射20min后，P<0.01）、（7.58±0.67）mM（40min后，P<0.01）、（3.56 ± 0.96）mM（2h后，P<0.01）并在4h后減少到正常水平（F=1.514），而腦脊液鎂離子濃度未發(fā)生明顯改變（F =126.884，P>0.05）。 結(jié)論 小鼠腦脊液鎂離子濃度不隨血清鎂離子濃度升高而改變。

[關(guān)鍵詞] 血-腦屏障；腦脊液；鎂離子；小鼠；血清

[中圖分類號(hào)] R651 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）17-23-04

Influence of changes of cerebrospinal fluid magnesium concentration and serum magnesium concentration in mice

SHEN Yanling1 WANG Jiao1 SUN Liyuan1，2

1.Department of Pathology， Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guangxi， Guilin 541004， China； 2.Staff Room of Pathophysiology， Guilin Medical University， Guangxi， Guilin 541004， China

[Abstract] Objective To study the influence of changes of cerebrospinal fluid magnesium concentration and serum magnesium concentration in mice. Methods To anaesthetize animal using by pentobarbital sodium （50mg/kg）. To shear off the mice tail at 1-1.5cm rattail tip to collect blood， to peel the skin and muscle on mice posterior neck to expose endocranium， to absorb cerebrospinal fluid at cisterna magna used by butterfly needle. To detect the cerebrospinal fluid and serum magnesium concentration of C57BL/6 （B6） and ICR mice by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）， to detect the changes of cerebrospinal fluid and serum magnesium concentration in B6 mice which were treated with intraperitoneal injection magnesium sulphuricum（1.23g/kg） after 20min， 40min， 2h， 4h. Results The cerebrospinal fluid and serum magnesium concentration in B6 mice was （0.89±0.11） mM and （1.38±0.12） mM， while which was （1.00±0.12） mM and （1.10±0.09） mM in ICR mice. The serum magnesium concentration in B6 mice has increased from （1.38±0.12） mM to （8.68±1.85） mM after 20min intraperitoneal injection magnesium sulphuricum（P<0.01）， to （7.58±0.67） mM after 40min intraperitoneal injection magnesium sulphuricum（P<0.01）， to （3.56±0.96） mM after 2h intraperitoneal injection magnesium sulphuricum（P<0.01）， then reduced to normal level after 4h intraperitoneal injection magnesium sulphuricum（F=1.514）， while cerebrospinal fluid magnesium concentration hadnt occurrence obviously significant change（F=126.884，P>0.05）. Conclusion Cerebrospinal fluid magnesium concentration in mice dosnt has change along with serum magnesium concentration.

[Key words] Blood-brain barrier； Cerebrospinal fluid； Magnesium； Mice； Serum

鎂影響細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，如：鉀離子和鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)；調(diào)控信號(hào)的傳遞；酶原的激活；參

與能量代謝、核酸及蛋白質(zhì)的合成；調(diào)控細(xì)胞周期和保護(hù)細(xì)胞生物膜的完整。研究表明，一些疾病與鎂離子的缺乏有關(guān)，如：骨骼發(fā)育不良、腦卒中、繼發(fā)性腦損傷、缺血性心臟病、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病以及視網(wǎng)膜功能異常[1-3]。鎂離子缺乏是誘發(fā)關(guān)島帕金森病、PDC和ALS的主要的環(huán)境因素，并且有研究證明鎂離子缺乏可引起大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的選擇性缺失[4-6]。

一些臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，靜脈注射鎂離子能起到神經(jīng)元的保護(hù)作用：可以預(yù)防人類和動(dòng)物的創(chuàng)傷性腦損傷、癲癇發(fā)作、蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦缺血的發(fā)生；也可預(yù)防由利多卡因而誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作[1，7]。這些研究顯示鎂離子缺乏可誘導(dǎo)某些特定神經(jīng)元的變性，而在一定的病理?xiàng)l件下提高血清鎂離子濃度對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。

研究顯示人類和動(dòng)物的血清離子成分發(fā)生改變時(shí)，腦脊液的鎂離子濃度不會(huì)發(fā)生改變[7-12]。但腦部損傷的患者和狗（血清鎂離子濃度是正常血清鎂離子濃度的2～4倍）的腦脊液鎂離子濃度會(huì)有輕微的升高，子癇前期的患者和海馬區(qū)癲癇發(fā)作的大鼠腦脊液鎂離子濃度會(huì)有明顯的增加，并且長(zhǎng)期鎂離子缺乏會(huì)誘導(dǎo)腦脊液鎂離子濃度的降低[13-14]。

小鼠常被用于各種神經(jīng)疾病模型制作和鎂離子神經(jīng)保護(hù)性治療的研究。已有研究通過(guò)口服鎂離子研究其對(duì)帕金森模型小鼠以及SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠的干預(yù)效果[12-17]，但這些研究并沒(méi)有檢測(cè)血清和腦脊液以及腦組織中鎂離子濃度是否發(fā)生改變。另外，正常小鼠腦脊液鎂離子濃度以及改變血清鎂離子濃度對(duì)它是否產(chǎn)生影響目前也未見(jiàn)報(bào)道。本研究詳細(xì)闡明了B6型和ICR型小鼠正常腦脊液鎂離子濃度及B6型小鼠腹腔注射鎂離子后腦脊液鎂離子濃度的改變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康雄性B6型（n=27）和ICR型（n=11）小鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，8周齡，體重分別為21～24g、32～37g。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組 檢測(cè)B6型小鼠腹腔注射硫酸鎂（濃縮鎂離子，MgSO4·7H2O，1.23g/kg）20min、40min、2h、4h（各組均n=5）后腦脊液和血清鎂離子濃度的改變。

1.2.2 對(duì)照組 B6型（n=7）和ICR型（n=11）小鼠，取腦脊液、血清。

1.2.3 血清和腦脊液樣本采集 戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉動(dòng)物。在鼠尾尖端1～1.5cm處剪斷鼠尾，收集血液在含有聚丙烯的試管內(nèi)，并以1500rpm轉(zhuǎn)速離心分離。

經(jīng)枕大池收集腦脊液：剝離小鼠后頸部皮膚肌肉，暴露硬腦膜，使用蝶形針（27Gx×1/2，0.4×13 mm，TOP公司，東京，日本）在枕大池內(nèi)吸取腦脊液。對(duì)照組和B6型小鼠腹腔注射硫酸鎂20min、40min、2h、4h后收集樣本，并用超純水稀釋1000倍。

1.2.4 鎂離子濃度測(cè)定 用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，7500級(jí)，安捷倫科技，東京，日本）進(jìn)行鎂離子濃度的測(cè)定（為使標(biāo)準(zhǔn)化，樣本中加入1%的氮酸使標(biāo)本濃度為10μg/L）。每次檢測(cè)前儀器均使用超純水沖洗。操作條件如下：ICP rf 功率1500 W，冷卻室溫度為2℃；氬氣流量，血漿為0.7升/分鐘，載體為0.35升/分鐘；氫氣流量為0.4；質(zhì)譜掃描，Mg m/z = 25，Y m/z = 89。每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行三次測(cè)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。處理組間獨(dú)立樣本采用ANOVA方差分析，組間多重比較采用Bonferroni post hoc分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組數(shù)據(jù)用（）表示。

2 結(jié)果

超純水中鎂離子濃度范圍是（0.14 ± 0.12）mM（n=11），在可接受的誤差范圍內(nèi)，因此未對(duì)腦脊液和血清鎂離子濃度進(jìn)行修正。正常B6型小鼠腦脊液和血清鎂離子濃度分別是（0.89±0.11）mM（n=7）、（1.38±0.12）mM（n=7）。正常ICR型小鼠腦脊液和血清鎂離子濃度分別是（1.00±0.12）mM（n=7）、（1.10±0.09）mM（n=11）。B6型小鼠腹膜內(nèi)注射硫酸鎂后血清鎂離子濃度從（1.38±0.12）mM（正常水平；n= 5）增加到（8.68±1.85）mM（注射20分鐘后；n=5）、（7.58±0.67）mM（40分鐘后；n=5）、（3.56±0.96）mM（2小時(shí)后； n=5），并在4小時(shí)（n=5）后減少到正常水平，腦脊液鎂離子濃度未發(fā)生明顯改變（圖1）。見(jiàn)表1。

圖1 腹腔注射鎂離子后腦脊液和血清鎂離子濃度。*與對(duì)照組比校，P<0.01

3 討論

本實(shí)驗(yàn)闡明了正常腦脊液鎂離子濃度及改變血清鎂離子濃度對(duì)它的影響。B6型和ICR型小鼠腦脊液鎂離子濃度分別是（0.89±0.11）mM、（1.00±0.12）mM。B6型小鼠血清鎂離子濃度增加時(shí)腦脊液鎂離子濃度不發(fā)生明顯改變。B6型小鼠血清和腦脊液鎂離子濃度分別是1.38 mM、0.89 mM，ICR型小鼠血清和腦脊液鎂離子濃度分別是

表1 不同物種的腦脊液和血清正常鎂離子濃度及補(bǔ)充鎂后腦脊液鎂離子濃度的變化

物種 品系 年齡 性別 正常鎂離子濃度血漿 腦脊液CSF 補(bǔ)充鎂后CSF/血清中鎂離子濃度的改變 鎂離子濃度的檢測(cè)方法 引用

小鼠 C57BK/6J 8周 雌性 （1.38±0.12） mM/L （0.89±0.11） mM/L CSF中鎂離子無(wú)明顯改變 ICP-MS Present study

C57BK/6J 雌性 （2.8±0.1）mg/dL AAS Marie et al. 1983

ICR 8周 雌性 （1.10±0.09） mM/L （1.00±0.12） mM/L ICP-MS Present study

SOD-1 Tg 腦組織中鎂離子無(wú)明顯改變 ICP-MS Pamphlett et al. 2003

A/J 成年 雌性 17000 ?g/mL ICP-MS Funseth et al. 2000

Balb/c 雄性 24284ng/gwet weight ICP-MS Ilb?ck et al. 2003

大鼠 Wistar 雄性 （1.96±0.24） mg/dL （2.06±0.16） mg/dL AAS Hoffman et al. 1990

Sprague-Dawley （2.0±0.1） mg/dL 腦組織中鎂離子無(wú)明顯改變 calmagite dye Choi et al. 1991

Long-Evans 雄性 （2.4±0.25） mg/dL （2.41±0.14） mg/dL CSF中鎂離子無(wú)明顯改變 Colorimetry Hallak et al. 1992

豚鼠 0.97 mM/L 0.81 mM/L AAS Scheibe et al. 1999

貓 1.35 mEq/kg H2O 1.33 mEq/kg H2O Ames III et al. 1964

兔子 白兔 成年 （2.09±0.36） mEq/L 腦組織中鎂離子無(wú)明顯改變 AAS Hilmy et al. 1968

（0.72±0.13） mM/L （0.90±0.20） mM/L HPLC Frosini et al. 1993

狗 混血 1.61 （1.33～2.0） mEq/L 2.16（1.93～2.9）mEq/L CSF中鎂離子改變明顯 FS Oppelt et al. 1963

豬 幼崽 2～40d 腦組織中鎂離子無(wú)明顯改變 PMRS Gee et al. 2001

山羊 2.2 mEq/kg H2O 1.9 mEq/kg H2O Pappenheimer et al. 1962

人 健康 成人 雄性 （1.44±0.16） mg/dL （2.56±0.19） mg/dL CSF中鎂離子輕微但改變明顯 modified MBCP Thurnau et al. 1987

對(duì)照組 成人 （1.69±0.14） mEq/L （2.29±0.1） mEp/L AAS Heipertz et al. 1979

術(shù)后患者 成人 （1.91±0.26） mg/dL （2.67±0.44） mg/dL CSF中鎂離子無(wú)明顯改變 CPN Ko et al.2001

患者 18～89歲 男/女 Mg2+：（0.92±0.18） mM/L Mg2+：（1.25±0.14） mM/L CSF中鎂離子輕微但改變明顯 ACCA McKee et al.2005

高血壓患者 成人 （0.58±0.05） mM/L （0.82±0.06） mM/L CSF中鎂離子無(wú)明顯改變 EA Brewer et al. 2001

注：AAS：原子吸收光譜法； ACCA：臨床自動(dòng)化學(xué)分析儀；CPN：偶氮氯膦三；EA：電解質(zhì)分析儀；ES： 發(fā)射分光光度測(cè)定法；FS：火焰光譜測(cè)定法；HPLC：高效液相測(cè)普法；ICP-MS：電感耦合等質(zhì)譜儀；MBCP： 甲基百里酚藍(lán)絡(luò)合過(guò)程；PMRS：磷-31核磁共振光譜法，數(shù)字代表平均值±SD

1.10 mM、1.00 mM。B6型和ICR型小鼠鎂離子濃度差異以及B6型小鼠血清和腦脊液鎂離子濃度差異的原因以及生理作用目前尚不清楚。

小鼠血清鎂離子濃度稍高于其他種屬的血清鎂離子濃度（表1） [16-18]。一些動(dòng)物如小鼠、豚鼠、貓、山羊的血清鎂離子濃度高于腦脊液鎂離子濃度，但大鼠、兔、狗和人類血清鎂離子濃度相對(duì)稍低（表1）[8-9，13-14，19-22]。種屬間血清鎂離子濃度差異的原因尚不明確。

已有研究表明，正常人和動(dòng)物血清鎂離子濃度即使升高200%，而腦脊液鎂離子濃度卻不會(huì)發(fā)生明顯增加[8]。另有研究證實(shí)，給新出生豬靜脈注射硫酸鎂或SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠口服補(bǔ)充鎂后腦組織中的鎂離子濃度也未增加（表1）[8，12]。

也有部分研究表明血清鎂離子濃度升高后腦脊液鎂離子濃度會(huì)隨之提高。大鼠腹腔注射硫酸鎂后血清鎂離子濃度明顯增高，而腦脊液鎂離子濃度有輕微提高，2h后腦脊液和血清鎂離子濃度均有所下降。Oppelt等發(fā)現(xiàn)如果血清鎂離子濃度持續(xù)升高3～4h，腦脊液鎂離子濃度將會(huì)升高到121%的水平[14]。Thurnau等報(bào)道子癇患者靜脈注射硫酸鎂后腦脊液鎂離子水平增加到119%的水平，而健康成人則達(dá)到400～500%的水平。McKee等 [13]觀察到對(duì)各類患者系統(tǒng)性給于鎂離子后腦脊液鎂離子濃度有輕微的增高。另一方面，長(zhǎng)期嚴(yán)重的低鎂血癥會(huì)引起腦脊液鎂離子濃度發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠血清鎂離子濃度增高時(shí)腦脊液鎂離子濃度未發(fā)生改變（圖1，表1）。

根據(jù)腦脊液鎂平衡機(jī)制，Oppelt等認(rèn)為：狗完整的血-腦脊液屏障對(duì)鎂離子不滲透[14]。Hilmy等也認(rèn)為正常兔子的大腦受血-腦屏障的保護(hù)來(lái)確保腦脊液鎂離子濃度的平衡[11]。然而，在大腦損傷的情況下，如外傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血或中風(fēng)，這種保持腦脊液鎂離子濃度體內(nèi)平衡的機(jī)制就會(huì)遭到破壞[23-25]。

一些研究嘗試對(duì)神經(jīng)變性疾病小鼠模型使用鎂離子進(jìn)行治療：對(duì)ALS模型（SOD-1轉(zhuǎn)基因小鼠）口服補(bǔ)充鎂離子后未觀察到干預(yù)效果，且腦組織鎂離子濃度也未增加；給帕金森病模型小鼠口服鎂離子后，雖然能改善其行為學(xué)表現(xiàn)，但紋狀體多巴胺含量未增加[12，15]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以前的研究表明在使用鎂離子用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠動(dòng)物模型時(shí)有必要直接對(duì)腦組織或者蛛網(wǎng)膜下腔/側(cè)腦室給藥。

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（收稿日期：2015-06-02）