方陵生/編譯

CRISPR：強(qiáng)大的基因編輯工具

方陵生/編譯

一項(xiàng)叫做CRISPR的DNA編輯技術(shù)已快速成為最受歡迎的基因組修飾方法之一。然而，對(duì)其可能產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂似乎給它的一些實(shí)際用途降了溫——CRISPR可被用于人類胚胎的修飾，也適用各種動(dòng)植物的基因修飾，從小麥到老鼠，甚至可被用來(lái)改變野生動(dòng)物的種群。對(duì)此，《自然》雜志綜合了最新的研究進(jìn)展和從事基因組編輯專家的意見(jiàn)，對(duì)CRISPR及其產(chǎn)生的影響進(jìn)行了報(bào)道。

三年前，新的基因編輯工具的引入，改變了布魯斯·康克林的實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展方向

●自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)以來(lái)，CRISPR是生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)最大的“游戲規(guī)則”改變者，這一強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)在給生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展帶來(lái)巨大潛力的同時(shí)，也產(chǎn)生了一些引起人們擔(dān)憂的緊迫問(wèn)題。

舊金山格萊斯頓研究所的遺傳學(xué)家布魯斯·康克林（Bruce Conklin），一直在試圖尋找DNA變化與人類疾病之間的聯(lián)系，但實(shí)驗(yàn)工具復(fù)雜且低效：當(dāng)他對(duì)從患者身上采集的細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)，難以分清楚哪些DNA序列與疾病相關(guān)，哪些是不相干的冗余信息。他認(rèn)為，通過(guò)基因工程令細(xì)胞產(chǎn)生突變不僅是一項(xiàng)艱苦的工作，甚至某個(gè)基因的改變需要一個(gè)學(xué)生付出整整一學(xué)期的努力。

2012年，當(dāng)康克林看到一項(xiàng)稱為CRISPR的技術(shù)可快速改變包括人類在內(nèi)的幾乎任何生物的DNA，他便毅然放棄了之前的疾病建模方式，采用了這種新的基因編輯方法。如今，他的實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行著與各種心臟疾病有關(guān)的基因修飾工作。他說(shuō)：“CRISPR改變了一切，讓我們走出了困境?！?/p>

與其他基因編輯技術(shù)不同的是，CRISPR成本低廉、使用方便快捷，研究人員希望用它來(lái)調(diào)整人類基因，消除疾病根源，創(chuàng)造出生命力更強(qiáng)的植物以及更多地造福人類?！癈RISPR和PCR是科學(xué)事業(yè)發(fā)展中的兩個(gè)重要的里程碑?！奔~約伊薩卡康奈爾大學(xué)的遺傳學(xué)家約翰·希曼蒂（John Schimenti）說(shuō)道。PCR的基因擴(kuò)增方法，自1985年以來(lái)徹底改變了基因工程的面貌，而“CRISPR將從多個(gè)方面對(duì)生命科學(xué)產(chǎn)生影響?！?/p>

由于這一領(lǐng)域的快速發(fā)展，一些科學(xué)家開(kāi)始擔(dān)心，這幾乎沒(méi)有留給我們多少時(shí)間來(lái)思考解決這類實(shí)驗(yàn)可能產(chǎn)生的道德和安全問(wèn)題。今年4月，有關(guān)CRISPR將對(duì)人類胚胎進(jìn)行基因工程設(shè)計(jì)的消息一經(jīng)傳開(kāi)，就成為了眾人關(guān)注的焦點(diǎn)。雖然胚胎實(shí)驗(yàn)并不會(huì)導(dǎo)致基因改造的嬰兒出生，但依然產(chǎn)生了激烈的爭(zhēng)論，爭(zhēng)論的焦點(diǎn)是：CRISPR是否應(yīng)該或如何對(duì)人類基因組改造，CRISPR在基因編輯中是否會(huì)產(chǎn)生意外失控等潛在風(fēng)險(xiǎn)，以及對(duì)生物體基因編輯是否會(huì)破壞整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)？

加州斯坦福大學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)家斯坦利·齊（Stanley Qi）說(shuō)道：“CRISPR在實(shí)驗(yàn)室里很容易利用和發(fā)揮。它不需要昂貴的設(shè)備，也不需要多年的培訓(xùn)就能使用。但我們需要認(rèn)真思考的是如何駕馭這種力量?！?/p>

基因編輯技術(shù)的革命

事實(shí)上，十年前分子生物學(xué)家就開(kāi)始利用一些工具對(duì)基因組進(jìn)行編輯。馬薩諸塞州布蘭代斯大學(xué)的分子生物學(xué)家詹姆斯·哈伯（James Haber）說(shuō)道，一種稱為鋅指核酸酶的酶能夠有效地完成這項(xiàng)工作，但其成本高昂，一直未能被廣泛采用。而CRISPR的工作原理完全不同，它依賴一種叫做Cas9的酶，可在某種RNA分子的引導(dǎo)下瞄準(zhǔn)目標(biāo)DNA，然后對(duì)其進(jìn)行編輯，或敲除不需要的基因，或插入需要的序列。研究人員通常只需訂購(gòu)RNA片段即可，其他組件可以買(mǎi)現(xiàn)成的，成本只需30美元。“CRISPR令基因編輯操作變得簡(jiǎn)單化。這是一個(gè)巨大的變革?！惫f(shuō)。

CRISPR的出現(xiàn)，意味著一些人要放棄他們多年來(lái)已經(jīng)用得相當(dāng)順手的技術(shù)。英國(guó)威康信托基金會(huì)桑格研究所的遺傳學(xué)家比爾·斯卡內(nèi)斯（Bill Skarnes）說(shuō)道：“盡管我很沮喪，但同時(shí)我也很興奮?！敝?，斯卡內(nèi)斯使用的是1980年代中期引入的技術(shù)：將DNA插入胚胎干細(xì)胞，然后利用這些細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，不僅耗時(shí)成本也昂貴。而CRISPR對(duì)基因編輯所花費(fèi)的時(shí)間只是原先工具的幾分之一。兩年前，斯卡尼斯采用了CRISPR技術(shù)。

通常，實(shí)驗(yàn)對(duì)象大部分是老鼠和果蠅等生物體，如今CRISPR可以對(duì)更多生物體進(jìn)行基因編輯，研究人員可以有更多的選擇。今年4月，馬薩諸塞州劍橋懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所的研究人員報(bào)道稱，他們使用CRISPR對(duì)白色念珠菌進(jìn)行了基因編輯（這種真菌對(duì)于免疫力較弱的人可能是致命的），而之前在實(shí)驗(yàn)室一直難以對(duì)其進(jìn)行基因操作?；蚓庉嬒闰?qū)、伯克利加州大學(xué)的詹妮弗·多娜（Jennifer Doudna）迄今已利用CRISPR對(duì)多達(dá)36個(gè)生物體進(jìn)行了基因操作，其中包括錐蟲(chóng)的致病寄生蟲(chóng)和用于制造生物燃料的酵母。

然而，CRISPR的快速發(fā)展也存在一些不足。舊金山加利福尼亞大學(xué)的生物物理學(xué)家黃波（音譯）說(shuō)道：“首先，沒(méi)有時(shí)間對(duì)該系統(tǒng)的一些基本參數(shù)進(jìn)行描述。一種普遍的想法是，用得順手就行，不用過(guò)多的考慮其原理?！秉S波和實(shí)驗(yàn)室同事花了兩個(gè)月的時(shí)間，才將CRISPR正式用于成像研究。他說(shuō)，如果知道如何優(yōu)化向?qū)NAs的設(shè)計(jì)，磨合時(shí)間可能會(huì)更短一些。向?qū)NAs優(yōu)化設(shè)計(jì)可產(chǎn)生細(xì)微但很重要的差別。

在研究人員看來(lái)，這些不盡如人意之處是掌握新技術(shù)所需付出的極小代價(jià)，但在多娜看來(lái)，她更多擔(dān)心的是安全問(wèn)題。在2014年的一次會(huì)議上，當(dāng)她看到一項(xiàng)成果時(shí)就開(kāi)始了這種擔(dān)憂，即一位博士后將經(jīng)過(guò)基因工程改造的CRISPR病毒組件進(jìn)入老鼠體內(nèi)，讓CRISPR系統(tǒng)對(duì)變異進(jìn)行基因修飾，以此創(chuàng)建一個(gè)人類肺部癌細(xì)胞模型。多娜對(duì)此感到不寒而栗，因?yàn)槿绻驅(qū)NA設(shè)計(jì)存在一個(gè)小小瑕疵，就可能導(dǎo)致肺部出現(xiàn)大問(wèn)題?！白寣W(xué)生來(lái)處理此類事情是很可怕的，”她說(shuō)，“重要的是要讓人們清楚地認(rèn)識(shí)到這種技術(shù)能用來(lái)做什么?！?/p>

紐約紀(jì)念斯隆-凱特林癌癥中心的安德烈·文圖拉（Andrea Ventura）說(shuō)，向?qū)NA設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因組區(qū)域是老鼠獨(dú)有的，其病毒是不完整的。重要的是要預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)，哪怕是比較遙遠(yuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)?！跋?qū)NA設(shè)計(jì)的目的不是破壞人類基因組，但其產(chǎn)生的后果我們可能永遠(yuǎn)無(wú)法知道，”他說(shuō)，“雖然這種情況不太可能出現(xiàn)，但仍然需要慎重的加以防范?！?/p>

對(duì)疾病基因進(jìn)行編輯

去年，劍橋麻省理工學(xué)院的生物工程師丹尼爾·安德森（Daniel Anderson），和同事們通過(guò)老鼠的CRISPR糾正了一種與遺傳性高酪胺酸血癥有關(guān)的人類代謝疾病的突變基因，邁出了利用基因技術(shù)治療人類疾病的重要一步。這也是首次通過(guò)CRISPR修復(fù)成年生物體致病突變的一個(gè)例子。

在基因治療領(lǐng)域，盡管CRISPR潛力巨大，但安德森的研究表明今后還有很長(zhǎng)的路要走，例如，要將Cas9酶及向?qū)NA引入肝臟器官中，他們不得不將大量的液體注入血管。通常，實(shí)驗(yàn)修正的只是0.4%的致病突變細(xì)胞，因此這并不足以對(duì)很多疾病產(chǎn)生影響。

安德森等人認(rèn)為，基因療法的第一個(gè)臨床試驗(yàn)可能出現(xiàn)在未來(lái)一到兩年內(nèi)，其過(guò)程可能會(huì)是：將CRISPR組件直接注入眼部等人體組織內(nèi)，或在實(shí)驗(yàn)室把從人體內(nèi)抽取的細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，然后再放回體內(nèi)——糾正后的造血干細(xì)胞可治療鐮狀細(xì)胞病或β-地中海貧血癥等疾病。而將酶和向?qū)NA引入其他更多組織是一個(gè)更大的挑戰(zhàn)，盡管研究人員希望這項(xiàng)技術(shù)未來(lái)可治療更多的遺傳疾病。

有許多科學(xué)家告誡說(shuō)，在安全有效使用CRISPR之前，我們還有許多的工作要做。即在提高基因編輯效率的同時(shí)，確保不會(huì)對(duì)其他至關(guān)重要的健康基因產(chǎn)生不利影響。哈伯說(shuō)：“引入的酶只針對(duì)設(shè)計(jì)標(biāo)靶，這一點(diǎn)至關(guān)重要。如果你想在干細(xì)胞內(nèi)取代某人的鐮狀細(xì)胞基因，首先要保證不會(huì)對(duì)其他基因造成危害?！?/p>

在從事基因編輯的研究中，馬薩諸塞州波士頓總醫(yī)院的基思·喬恩（Keith Joung）開(kāi)發(fā)了一個(gè)跟蹤C(jī)as9偏離移除標(biāo)靶的方法。他說(shuō)，從一種細(xì)胞到另一種細(xì)胞，從一個(gè)基因序列到另一個(gè)基因序列，基因移除偏離目標(biāo)的幾率相差很大。他和其他一些實(shí)驗(yàn)室的突變頻率偏離標(biāo)靶的幾率從0.1%到60%以上。他說(shuō)，即使是幾率較低的意外事件，如果會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞加速生長(zhǎng)和癌癥，也是很危險(xiǎn)的。

面對(duì)如此多懸而未決的問(wèn)題，馬薩諸塞州劍橋Editas公司首席執(zhí)行官卡特琳·博斯利（Katrine Bosley）認(rèn)為，關(guān)鍵是要把控對(duì)CRISPR的預(yù)期，同時(shí)要讓別人相信你的方法可行?！皩?duì)于我們而言必須要從現(xiàn)實(shí)考慮這樣一個(gè)問(wèn)題：它會(huì)將我們帶向哪里？”Editas是一家開(kāi)發(fā)CRISPR的基因療法公司。

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的影響

除了對(duì)人類DNA細(xì)胞的修飾，CRISPR的另一目標(biāo)是農(nóng)作物和牲畜。在基因編輯技術(shù)出現(xiàn)之前，研究人員通常將某個(gè)基因和細(xì)菌、病毒或其他驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)物種的基因序列，插入到目標(biāo)基因組的隨機(jī)位置。其過(guò)程不僅低效，也一直成為評(píng)論家們的眾矢之的，擔(dān)心這種基因插入可能會(huì)破壞原有的基因。更重要的是，轉(zhuǎn)基因作物的培植和獲得批準(zhǔn)的過(guò)程代價(jià)及其高昂和繁復(fù)。目前轉(zhuǎn)基因作物多為玉米和大豆等商品化產(chǎn)品。

有了CRISPR，情況會(huì)有所改觀——易用性和低成本特性使得基因組編輯有了更多的“用武之地”。過(guò)去幾年里，CRISPR創(chuàng)造了基因工程小型豬、去角牛和抗病山羊，以及抗病害的小麥、大米和多維甜橘等。多娜預(yù)計(jì)，經(jīng)CRISPR修飾的有機(jī)體物種名單會(huì)繼續(xù)增加。她說(shuō)：“這是植物基因工程實(shí)驗(yàn)的又一個(gè)發(fā)展機(jī)遇，無(wú)論從研究的角度，或家庭菜園的角度而言，都是一次很有意義的嘗試?！?/p>

CRISPR具有對(duì)DNA序列編輯的能力，使得更為精確的基因修飾成為可能，但也給監(jiān)管部門(mén)帶來(lái)了難題——很難對(duì)某個(gè)基因修飾的有機(jī)體進(jìn)行確認(rèn)?！盎蚓庉嫷膯?wèn)世，導(dǎo)致人們失去了對(duì)基因工程產(chǎn)品跟蹤的能力,”北卡羅萊納州立大學(xué)從事科技政策研究的詹妮弗·庫(kù)茲瑪（Jennifer Kuzma）說(shuō)道，“以后或?qū)⒑茈y判斷動(dòng)植物的基因是自然變異，還是基因編輯修飾的產(chǎn)物?！?/p>

這給轉(zhuǎn)基因作物的反對(duì)者們敲響了警鐘，同時(shí)也給如何監(jiān)管基因編輯的動(dòng)植物提出了難題。在美國(guó)，食品和藥物管理局尚未批準(zhǔn)任何供人類消費(fèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，也未表明將如何對(duì)待基因編輯的動(dòng)物。而現(xiàn)有的一些規(guī)定，并不是所有的基因編輯作物都需要美國(guó)農(nóng)業(yè)部的監(jiān)管。今年5月，美國(guó)農(nóng)業(yè)部開(kāi)始尋求如何提高對(duì)轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管的力度，許多人認(rèn)為這是一種預(yù)示，表明針對(duì)CRISPR等技術(shù)，農(nóng)業(yè)部將重新評(píng)估其相關(guān)規(guī)則。庫(kù)茲瑪說(shuō)道：“窗口已打開(kāi)，我們拭目以待，這是一個(gè)令人興奮的事實(shí)?！?/p>

除了農(nóng)作物和牲畜之外，研究人員正在考慮CRISPR是否可以應(yīng)用在一些野生生物上。目前大部分注意力都集中在一種稱為基因驅(qū)動(dòng)的新技術(shù)，即將外源基因快速引入動(dòng)物群體，由此消除相關(guān)疾病或?qū)οx(chóng)害和入侵物種進(jìn)行控制。這項(xiàng)目前還處于早期階段的技術(shù)主要用以消滅攜帶病毒的蚊子或虱子，以及控制入侵植物或消除困擾一些農(nóng)民的豬草抗藥性。

通常，基因變化在生物群體中需要傳播很長(zhǎng)時(shí)間，緣由是一對(duì)染色體上的其中一個(gè)變異只能遺傳給一半后代。而基因驅(qū)動(dòng)能讓CRISPR導(dǎo)致的某個(gè)突變由每一對(duì)染色體的一半復(fù)制到其另一半上，而其后代幾乎都將繼承這一變異，這意味著它將快于正常的增長(zhǎng)速度在整個(gè)群體中以指數(shù)級(jí)速度傳播。比如，一旦突變基因進(jìn)入蚊子體內(nèi)，僅一個(gè)季節(jié)就會(huì)在整個(gè)種群中快速傳播開(kāi)來(lái)，如果該突變基因?qū)е挛米赢a(chǎn)生更少后代，最終整個(gè)蚊子種群連同它們攜帶的瘧疾寄生蟲(chóng)都會(huì)自行消亡。

發(fā)展前景的喜與憂

然而，許多研究人員擔(dān)心，改變某個(gè)物種或完全消除它們，對(duì)于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的未知后果，或出現(xiàn)其他害蟲(chóng)，或影響到高端食物鏈。研究人員還擔(dān)心，隨著時(shí)間的推移，向?qū)NA也可能會(huì)變異，將目標(biāo)轉(zhuǎn)向基因組的其他不同部位。這種突變可以通過(guò)物種群體快速蔓延，從而產(chǎn)生不可預(yù)知的影響。

“突變具有不可逆性，會(huì)對(duì)其他物種可能產(chǎn)生意想不到的或難以預(yù)料的影響和風(fēng)險(xiǎn)?！辈ㄊ款D哈佛醫(yī)學(xué)院的合成生物學(xué)家喬治·丘奇（George Church）說(shuō)道。去年4月，丘奇等專家在《科學(xué)》上就這種風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)警，并提出基因驅(qū)動(dòng)實(shí)驗(yàn)意外泄漏的防范方法。

在當(dāng)時(shí)，基因驅(qū)動(dòng)似乎還是一個(gè)遙遠(yuǎn)前景。但不到一年，圣地亞哥加州大學(xué)的發(fā)育生物學(xué)家伊?！け纫翣枺‥than Bier）和他的學(xué)生瓦倫蒂諾·甘茨（Valentino Gantz）報(bào)告稱，他們用果蠅設(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)，即在攜帶瘧疾病毒蚊子的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)把果蠅放進(jìn)采取了安全措施的三層盒子內(nèi)，但他們沒(méi)有完全遵照諸如設(shè)計(jì)一種逆向基因改變指南行事。比伊爾說(shuō)，他們正在進(jìn)行第一個(gè)理論驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在系統(tǒng)復(fù)雜化之前，他們想要確認(rèn)其是否真正可行。

對(duì)于丘奇等人來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)明確的警告，CRISPR引發(fā)的基因編輯普及可能會(huì)產(chǎn)生一些意想不到的不良后果。美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)為此專門(mén)成立了一個(gè)基因驅(qū)動(dòng)問(wèn)題討論小組，其他高層討論也開(kāi)始跟進(jìn)?！爸陵P(guān)重要的是，國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)和國(guó)際組織要真正做好相關(guān)的預(yù)案?！甭槭±砉W(xué)院“科學(xué)評(píng)論”主要作者肯尼思·奧耶（Kenneth Oye）說(shuō)道。奧耶擔(dān)心，基因驅(qū)動(dòng)科學(xué)正在高速發(fā)展，相關(guān)的監(jiān)管步子很可能跟不上。

德州農(nóng)工大學(xué)學(xué)院站分校的昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)家米奇·尤班克斯（Micky Eubanks）說(shuō)道，基因驅(qū)動(dòng)的想法一開(kāi)始令他震驚。“我最初的反應(yīng)是，‘哦，我的上帝！這太可怕了！’但如果對(duì)已經(jīng)和繼續(xù)導(dǎo)致的環(huán)境變化進(jìn)行更多的思考和權(quán)衡，這只不過(guò)是大海中的一滴水罷了。”

當(dāng)CRISPR或其他一些新技術(shù)出現(xiàn)時(shí)，研究人員的心情不外乎夾雜著興奮和擔(dān)心，當(dāng)遭遇挫折時(shí)便會(huì)感到失望。1990年代，費(fèi)城賓夕法尼亞大學(xué)的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家詹姆斯·威爾遜（James Wilson）見(jiàn)證了當(dāng)時(shí)蓬勃發(fā)展的基因治療研究熱情，也見(jiàn)證了因臨床意外導(dǎo)致一個(gè)年輕人死亡。之后，這一領(lǐng)域的研究陷入低潮，直到最近才開(kāi)始有所恢復(fù)。威爾遜說(shuō)，CRISPR是個(gè)很年輕的領(lǐng)域，可能還需要一段時(shí)間的發(fā)展才能實(shí)現(xiàn)其潛力，“目前還在探索階段，一些想法都需要‘發(fā)酵’?！?/p>

在威爾遜的實(shí)驗(yàn)室引入這一技術(shù)之前，盡管他對(duì)有關(guān)CRISPR前景的一切承諾都持懷疑態(tài)度。但威爾遜相信：“它在人類醫(yī)學(xué)治療中最終會(huì)發(fā)揮作用，它的前景真的很引人入勝?！?/p>

[資料來(lái)源：Nature][責(zé)任編輯：則鳴]