代仕高，程秦明，賀 維，辜云杰，賈 晨，李佳泳，張 煒

(1.四川林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081;2.稻城縣林業(yè)局，四川 稻城 627750;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 雅安 625014)

楊樹是世界各國(guó)普遍種植的木本植物，屬楊柳科(Salicacea)楊屬(Populus L.)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、豐產(chǎn)等特性，已被廣泛作為短期輪作的造林樹種，在生態(tài)環(huán)境治理和解決木材短缺方面占有重要地位［1］，共分為胡楊派、白楊派、黑楊派、青楊派和大葉楊派五大派系。光果西南楊(Populus schneideri var.tibetica)屬青楊派(Section tacamchaca spach)，為我國(guó)特有樹種，主要分布于四川西部、西藏西部至東南部地區(qū)，海拔可達(dá)3 900 m，胸徑年平均生長(zhǎng)量1.1 cm以上，樹高年平均生長(zhǎng)量0.8 m以上，是一種適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、材質(zhì)優(yōu)良的速生樹種［2］。近年來(lái)，作為在川西高原寬谷地帶推廣的主要樹種，光果西南楊的大面積營(yíng)造，不但可以加快高原寬谷區(qū)的荒地綠化，提高森林覆蓋率;還能滿足用材、水土保持、水源涵養(yǎng)、防風(fēng)固沙等方面的需要，較好地發(fā)揮生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。植物組織培養(yǎng)作為在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖出性狀一致的良種的最佳途徑，有效合理的運(yùn)用可以使大面積造林更加快捷、便利。

盡管楊樹的組織培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，但對(duì)不同的楊樹品種而言，外植體、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和溫度、光照等因子的作用存在較大差別，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中做出必要的調(diào)整，通過(guò)對(duì)各個(gè)因子的優(yōu)化，獲得最佳的培養(yǎng)效果。因此，本研究以光果西南楊帶芽莖段為外植體，對(duì)組培過(guò)程中最佳培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，為光果西南楊苗木的大量繁殖以及遺傳改良提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

材料為1 a生光果西南楊(Populus schneideri var.tibetica)，從稻城縣采回光果西南楊的枝條，在成都扦插成活后備用。組織培養(yǎng)溫度均為(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 000 lx～1 500 lx，光照時(shí)間16 h·d-1。

1.2 外植體獲得

外植體通過(guò)以下兩種方法進(jìn)行選擇，方法一:楊樹扦插莖段萌發(fā)后，直接取帶芽莖段，去污劑清洗，流水沖洗30 min;方法二:扦插苗移栽后，溫室培養(yǎng)1-2個(gè)月左右，取帶芽莖段，去污劑清洗，流水沖洗30 min。結(jié)果顯示:方法二獲得帶芽莖段染菌率低，腋芽啟動(dòng)率高。

外植體消毒處理:先用70%(V/V)的酒精分別消毒 30 s、45 s、60 s;后用升汞(0.1%(W/V))分別消毒6 min、8 min、10 min，對(duì)比染菌率及致死情況，如表1。

1.3 不定芽誘導(dǎo)

誘導(dǎo)、增殖、壯苗和生根培養(yǎng)均采用MS基本培養(yǎng)基，外加3%蔗糖和0.6%瓊脂，pH為5.8。用無(wú)菌濾紙吸干帶芽莖段表面的水分，獲得無(wú)菌外植體。將無(wú)菌帶芽莖段接種于含不同濃度6-BA(0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1)和 NAA(1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、6.0 mg·L-1)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽。共6個(gè)處理，每個(gè)處理接15瓶，每瓶接種兩個(gè)外植體。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.4 再生芽增殖

將上述經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)得到的不定芽分株、切割，然后轉(zhuǎn)入NAA(0.1 mg·L-1)和不同濃度6-BA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)的繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上。共3個(gè)處理，每個(gè)處理接20瓶，每瓶接種兩個(gè)不定芽。20 d后觀察和統(tǒng)計(jì)不同激素濃度對(duì)再生芽形成的影響，計(jì)算增殖系數(shù)。

1.5 再生苗壯苗

經(jīng)過(guò)繼代增殖培養(yǎng)的無(wú)菌苗矮小，需進(jìn)一步繼代培養(yǎng)，此階段的試驗(yàn)?zāi)康脑谟谑篃o(wú)菌苗健壯和長(zhǎng)高。根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)，壯苗培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1+6-BA 0.5。

1.6 壯苗后生根

分別以MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA(0 mg·L-1、0.5 mg·L-1)。選取長(zhǎng)勢(shì)好的無(wú)菌苗，接種在生根培養(yǎng)基上，共3個(gè)處理，每個(gè)處理接20瓶，每瓶接種兩個(gè)無(wú)菌苗。15 d后開始觀察根的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)生根率。

1.7 生根苗移栽

取根系伸長(zhǎng)至2 cm～3 cm、植株高為3 cm～4 cm的幼苗進(jìn)行移栽。揭去培養(yǎng)瓶上的封口膜，在塑料大棚中煉苗3 d，注意保持培養(yǎng)基表面濕潤(rùn)。然后移栽到蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶1的基質(zhì)中，移栽時(shí)套袋保濕，3 d后，逐步去掉套袋。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和Microsoft Excel對(duì)試驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)資料進(jìn)行方差分析、LSD多重比較等。在結(jié)果統(tǒng)計(jì)中所涉及的測(cè)定項(xiàng)目計(jì)算公式如下:

誘導(dǎo)率(%)=長(zhǎng)出腋芽的外植體數(shù) /接種的外植體數(shù)×100

增殖系數(shù) =繼代后的不定芽數(shù) /接種不定芽數(shù)

生根率(%)=生根苗數(shù) /接種苗數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)外植體滅菌效果的影響

如表1所示，不同消毒處理對(duì)外植體滅菌效果的結(jié)果表明:70%(V/V)酒精消毒30 s，外植體染菌率高達(dá)90%(1號(hào)培養(yǎng)基);而酒精消毒60 s后培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，外植體出現(xiàn)死亡，莖段變黑現(xiàn)象(7、8、9號(hào)培養(yǎng)基)。70%(V/V)酒精消毒45 s后，再用0.1%(W/V)升汞消毒6 min，外植體染菌率高達(dá)45%(4號(hào)培養(yǎng)基);而消毒10 min后，出現(xiàn)啟動(dòng)遲緩甚至致死的現(xiàn)象(6號(hào)培養(yǎng)基)。由此可見(jiàn)，最佳處理方法為酒精消毒45 s，升汞消毒8 min，外植體的污染率僅5%(5號(hào)培養(yǎng)基)。

表1 不同消毒處理對(duì)外植體滅菌效果的影響Table 1 Effects of different disinfection on explants sterilizing

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

表2顯示，在本試驗(yàn)的不定芽分化中，NAA和6-BA的比例對(duì)不定芽分化影響較大。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，外植體芽誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢(shì)，且外植體莖段在(2)號(hào)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果最佳，10 d后腋芽萌發(fā)，芽誘導(dǎo)率達(dá)79%，30 d左右可以進(jìn)行增殖培養(yǎng)。而在6-BA濃度不變的情況下(2、5、6號(hào)培養(yǎng)基)，低濃度NAA明顯促進(jìn)芽誘導(dǎo)，而NAA濃度增加芽誘導(dǎo)率減小。故NAA與6-BA比例為1∶40時(shí)(2號(hào)培養(yǎng)基)，可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，增大外植體的芽誘導(dǎo)率。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of plant growth regulators on the induction of adventitious buds

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA對(duì)再生芽增殖的影響

從表3中可以發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基類型均為MS以及NAA濃度均為0.1 mg·L-1的情況下，不同濃度的6-BA對(duì)外植體再生芽增殖的影響不同。具體表現(xiàn)為:增殖系數(shù)隨6-BA濃度的升高逐漸增大，其中，(3)號(hào)培養(yǎng)基中增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)到5.8。再生芽增殖時(shí)，可能由于其自身可以合成內(nèi)源激素，故NAA與6-BA的比例與不定芽誘導(dǎo)相比稍有下降(比例為1∶20)。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA對(duì)再生芽增殖的影響Table 3 Effects of plant growth regulators 6-BA on the proliferation of regeneration buds

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA對(duì)生根的影響

在表4中，培養(yǎng)基中不添加NAA，將MS培養(yǎng)基與1/2MS培養(yǎng)基做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基對(duì)外植體莖段生根的促進(jìn)作用大于MS培養(yǎng)基，即(2)號(hào)培養(yǎng)基生根效果優(yōu)于(1)號(hào)。而在培養(yǎng)基類型一致(均為1/2MS)的條件下，添加0.5 mg·L-1NAA后生根率增加了15%，表明NAA對(duì)外植體的增根效果明顯，即(3)號(hào)培養(yǎng)基增根效果最佳。光果西南場(chǎng)帶芽莖段的不定芽誘導(dǎo)和再生情況見(jiàn)圖1。

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA對(duì)生根的影響Table 4 Effects of plant growth regulators NAA on the percentage of rooting

3 結(jié)論

光果西南楊組織培養(yǎng)效率受多個(gè)因子的影響。基本培養(yǎng)基能保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，但只有配合使用適當(dāng)?shù)耐庠醇に夭拍苷T導(dǎo)細(xì)胞分裂啟動(dòng)、愈傷組織生長(zhǎng)以及根、芽分化等合乎理想的變化［3］。常用于組織培養(yǎng)的植物激素有兩大類:即生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類。生長(zhǎng)素通常被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，而細(xì)胞分裂素主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽，對(duì)根的發(fā)生具有抑制作用［4］。在器官發(fā)生和增殖過(guò)程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例非常重要［5］。

圖1 光果西南楊帶芽莖段的不定芽誘導(dǎo)和植株再生Fig.1 Adventitious buds induction and plant regeneration of P.schneideri's stems with buds

污染、褐化、玻璃化被認(rèn)為是組織培養(yǎng)的3大殺手。與褐化、玻璃化相比污染更易發(fā)生，給科研和生產(chǎn)帶來(lái)巨大的危害。因此采取有效的防控措施，降低污染發(fā)生的機(jī)率，是組織培養(yǎng)成功的重要保障［6］。本實(shí)驗(yàn)中，在啟動(dòng)培養(yǎng)階段，采用溫室培養(yǎng)方法，獲得污染較少的帶芽莖段作為外植體，通過(guò)不同滅菌時(shí)間處理來(lái)控制污染，發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間過(guò)短滅菌不徹底，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)莖段變黑，啟動(dòng)遲緩甚至致死。結(jié)果顯示，酒精消毒45 s，升汞消毒8 min的滅菌效果最好，其污染率降到了5%，可以快速建立楊樹的無(wú)菌培養(yǎng)體系。

生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素在植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)器官分化的協(xié)同調(diào)控作用極為重要，需要針對(duì)具體外植體類型進(jìn)行細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素最適濃度及比例的篩選［7，8］。在不定芽的誘導(dǎo)和增殖階段，通過(guò)調(diào)節(jié)MS培養(yǎng)基中NAA和6-BA的配比，建立帶芽莖段分化不定芽的再生體系，在短期內(nèi)可以獲得大量的不定芽，提高光果西南楊的繁殖系數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，適宜濃度的6-BA有利于外植體誘導(dǎo)，而6-BA濃度過(guò)低或過(guò)高則不利于外植體誘導(dǎo);而低濃度的NAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用，高濃度具有抑制作用。這說(shuō)明:光果西南楊在不定芽誘導(dǎo)時(shí)主要依靠?jī)?nèi)源激素，少量的外源激素可補(bǔ)充內(nèi)源激素的不足促進(jìn)其抽芽［9］。在大部分的生根實(shí)驗(yàn)中，生根的基本培養(yǎng)基均采用1/2MS培養(yǎng)基［10，11］，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽分減半會(huì)促進(jìn)生根和側(cè)根發(fā)育［12］。本實(shí)驗(yàn)同樣采用1/2MS培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加適量NAA后生根率增加了15%，增根效果明顯，這加快了培養(yǎng)速度。

綜合已有的研究結(jié)果可以看出，較合適的組織培養(yǎng)模式是:MS為基本培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)腘AA和6-BA配比和適宜的培養(yǎng)環(huán)境。實(shí)際操作過(guò)程中，還應(yīng)針對(duì)不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)目標(biāo)，選擇相應(yīng)的技術(shù)措施。

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