劉濤 陶皇恒 王剛 方志海 楊中華 王行環(huán) 周家杰

腎細(xì)胞癌是腎腫瘤中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型（約占 原發(fā)性腎惡性腫瘤的90%），位居泌尿系腫瘤第2位（僅次于膀胱癌），占全身惡性腫瘤的2%～3%［1］。早期腎癌預(yù)后較好，保留腎單位腎部分切除術(shù)和腎癌根治性切除術(shù)往往能取得較好的療效。遺憾的是，腎癌臨床表現(xiàn)多變而隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上約1／3的患者在獲得確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為腎癌晚期［1］。而另一方面，腎癌對(duì)常規(guī)放化療均不敏感，導(dǎo)致腎癌（尤其是晚期腎癌）的臨床治療方案相對(duì)缺乏［2-3］。因此，尋找新的、安全而有效的抗腎癌藥物迫在眉睫。

辣椒素是辣椒等辛辣食物的主要有效成分，是一種香草酰胺類(lèi)衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為8-甲基-N-香草基-6壬烯基酰胺（C18H27NO3）。辣椒素對(duì)多種疾病（如疼痛［4］、皮膚?。?］、關(guān)節(jié)炎［6］等）具有廣泛治療效果，其抗癌效果也日益受到關(guān)注。但截至目前為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道辣椒素對(duì)腎癌細(xì)胞的作用效果及機(jī)制，因此，本課題組研究辣椒素誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞凋亡及相關(guān)分子機(jī)制，以探討辣椒素作為抗腎癌藥物的潛能。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人腎癌細(xì)胞株786-O（購(gòu)自 ATCC）用含10%血清，100IU／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（均購(gòu)至Gibco公司）。

二、MTT檢測(cè)

按照試劑盒（Corning Incorporated公司）說(shuō)明書(shū)逐步操作：786-O細(xì)胞以5×103的密度種在96孔板中，用不同濃度的辣椒素（使用抑制劑辣椒平時(shí)，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）處理，每組設(shè)置10個(gè)孔。分別孵育12、24和48h后，棄去液體，加入20μl的 MTT （5mg／ml，Sigma公司），37℃下孵育4h。然后小心除去上清，加入150μl DMSO。490nm下測(cè)定吸光度。

三、活性氧檢測(cè)

按照活性氧試劑盒（碧云天生物科技有限公司，南通）說(shuō)明書(shū)：先將786-O細(xì)胞種植于96孔板（每孔1×104細(xì)胞），用不同濃度的辣椒素（使用抑制劑辣椒平時(shí)，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）處理24h，然后更換培養(yǎng)液為含有終濃度為10μmol／L DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)液，避光孵育20min。再用無(wú)血清培養(yǎng)液清洗3遍，熒光酶標(biāo)板讀數(shù)。

四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至50%～70%融合度，加入含不同濃度辣椒素（使用抑制劑辣椒平時(shí)，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）的完全培養(yǎng)液。辣椒素孵育達(dá)指定時(shí)間后，胰酶消化，收集細(xì)胞，用含F(xiàn)ITC-Annexin V（PharMingen，San Diego，CA）以及PI的緩沖液室溫避光孵育5min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。此外，Hochest染色用于顯示凋亡形態(tài)學(xué)變化。前期處理同流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，辣椒素處理后，更換培養(yǎng)液為含有10μmol／L Hochest 33258染料的PBS，避光孵育30min，充分洗滌后再倒置熒光顯微鏡下觀察。

五、RT-PCR

786-O細(xì)胞總RNA用TRIzol（Invitrogen公司）提取，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo scientific公司）的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄條件：預(yù)變性94℃／2min；變性94℃／30s，退火60℃／30s，延伸72 ℃／60s，35 個(gè) 循 環(huán)；延 伸 72 ℃／10min。TRPV1上游引物：5′-TTCCGA GGG ATT CAG TAT TT-3′；下游引物：5′-TGA GCA GGA GGA TGT AGG TG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-AGA AGG ATT CCT ATG TGG GCG-3′，下游引物：5′-CAT GTC GTC CCA GTT GGT GAC-3′。

六、Western blot

細(xì)胞用PBS洗滌2次，1%Triton裂解緩沖液冰上裂解。BCA法測(cè)定蛋白濃度。95℃變性10min后，蛋白樣品在7.5%、10%、12.5%或15%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將載有蛋白的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次10min，然后與指定抗體共孵育4℃過(guò)夜。再次用TBST溶液漂洗3次10min后，與二抗室溫下作用2h。漂洗后用ECL顯色試劑盒顯色，并于暗室內(nèi)用膠片曝光、顯影及定影。所用抗體如下：抗TRPV1抗體（1∶200，＃ACC-030）購(gòu)至 Alomone Labs公司（Jerusalem，Israel）；抗 GAPDH 抗體（1∶1 000，sc-166574）購(gòu)至Santa Cruz Biotechnology公司（USA）；抗FADD抗體（1∶1 000，＃2782），抗caspase-3抗體（1∶500，＃9665），抗caspase-8抗體（1∶1 000，＃9496），抗caspase-9抗體 （1∶1 000，＃9502），均購(gòu)自 Cell Signaling Technologies公司（Danvers，MA）；抗 Bcl2 （1∶1 000，＃12789-1-AP），抗Bax（1∶1 000，＃50599-2-Ig）購(gòu)自ProteinTech Group公司（Chicago，USA）；抗c-myc（1∶1 000，＃ab32072）購(gòu)自 Abcam 公司 （Cambridge，UK）。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、辣椒素抑制細(xì)胞增殖

用不同濃度的辣椒素（0、50、100、200、300、400μmol／L）處理786-O細(xì)胞，分別檢測(cè)藥物作用12、24和48h的細(xì)胞存活率。細(xì)胞生存率曲線表明，辣椒素以劑量依賴(lài)關(guān)系和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系抑制786-O細(xì)胞存活率。如圖1所示，在48h組，與對(duì)照組相比，50、100、200、300、400μmol／L辣椒素使786-O細(xì)胞生存率分別下降了17.24%、35.10%、58.09%、64.80%。時(shí)間依賴(lài)性數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)使用200μmol／L辣椒素處理時(shí)，12、24和48h藥物孵育分別降低4.21%、20.72%、58.09%的細(xì)胞生存率。

二、辣椒素受體TRPV1在786-O細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)TRPV1在786-O細(xì)胞的表達(dá)情況。如圖2所示，無(wú)論在信使RNA水平還是在蛋白水平，786-O細(xì)胞中都檢測(cè)到TRPV1表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照為2株膀胱癌細(xì)胞T24和5637，本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)這2株細(xì)胞中TRPV1的表達(dá)［7-8］。此外，通過(guò)使用TRPV1特異性拮抗劑辣椒平，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用辣椒平預(yù)處理786-O細(xì)胞時(shí)，辣椒素對(duì)786-O細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)被顯著削弱，即辣椒平預(yù)處理后，400μmol／L辣椒素僅能引起18.39%的增殖抑制率，這甚至低于單獨(dú)使用200μmol／L辣椒素的效應(yīng)（圖1B）。這表明，TRPV1的確參與了辣椒素對(duì)786-O細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。

圖1 辣椒素對(duì)786-O細(xì)胞的增殖抑制

圖2 TRPV1的表達(dá)

三、辣椒素使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高

活性氧測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100、200和300μmol／L辣椒素分別增加了25.35%、83.74%和162.80%的活性氧水平（圖3）。同樣，辣椒平預(yù)處理也能對(duì)抗該效應(yīng)，圖3的數(shù)據(jù)顯示，辣椒平預(yù)處理后，300μmol／L辣椒素僅能引起23.49%的活性氧增加，這僅與單獨(dú)使用100μmol／L辣椒素的效應(yīng)相當(dāng)。

四、辣椒素誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100、200和300μmol／L辣椒素處理24h后細(xì)胞凋亡率分別為7.11%、11.13%和17.80%，與對(duì)照組（凋亡率1.98%）相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A和4B）。同樣，辣椒平預(yù)處理使得辣椒素促凋亡效應(yīng)也大大減弱，300μmol／L辣椒素單獨(dú)處理時(shí)凋亡率為17.80%，而加用辣椒平預(yù)處理后再用辣椒素時(shí)凋亡率僅為7.72%（圖4A和4B）。此外，Hochest染色顯示，辣椒素處理后，786-O細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了顯著的核濃縮和核碎裂現(xiàn)象，且凋亡形態(tài)學(xué)變化也能被辣椒平減弱（圖4C）。

圖4 辣椒素誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡及辣椒平對(duì)該效應(yīng)的影響

五、凋亡相關(guān)分子的變化

本實(shí)驗(yàn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)具有代表性的凋亡相關(guān)分子（包括c-myc、FADD、Bax及caspase-3、-8、-9裂解片段等）表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辣椒素處理能顯著促進(jìn)促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達(dá)，以及caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，而降低抗凋亡分子Bcl2的表達(dá)水平（圖5）。

圖5 凋亡相關(guān)分子的表達(dá)變化

討 論

辣椒作為食物調(diào)料和傳統(tǒng)藥物已有上千年歷史。流行病學(xué)資料顯示，偏食辣味食物的墨西哥人和印度人，其癌癥發(fā)病率遠(yuǎn)低于歐美人［9］。辣椒素是辣椒主要活性成分，它作為配體能刺激選擇性鈣通道TRPV1，引起該通道激活釋放Ca2＋流，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，從而引發(fā)一系列生理病理變化［10］。辣椒素對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病性神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺性神經(jīng)痛及銀屑病等的臨床療效已經(jīng)得到充分肯定［4-6］。近年來(lái)，有關(guān)辣椒素抗癌效應(yīng)的研究在國(guó)內(nèi)外均日益受到關(guān)注。研究初步證明辣椒素不僅在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞（如人膀胱癌［7，11］、前列腺 癌［12］、神 經(jīng) 膠 質(zhì) 瘤［13］和 胃 癌［14］等）的增殖具有顯著抑制效應(yīng)，并且破壞線粒體從而引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可以激活機(jī)體的抗腫瘤特異性免疫活性，此外還可抑制腫瘤新生血管形成［15］，但對(duì)正常健康細(xì)胞毒性作用極低［16］。這充分提示，作為一種天然食材成分，辣椒素具有成為新一代廣譜抗腫瘤藥物的潛力。

腎細(xì)胞癌對(duì)常規(guī)放化療不敏感，這對(duì)腎癌（尤其是晚期腎癌）的臨床治療帶來(lái)了極大的困難。截至目前為止，辣椒素對(duì)腎癌是否有效在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中均未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素能降低786-O細(xì)胞的存活能力，而該抑制效應(yīng)能被TRPV1拮抗劑辣椒平減弱，說(shuō)明TRPV1參與了辣椒素786-O細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)。更進(jìn)一步地研究還發(fā)現(xiàn)辣椒素能引起顯著的細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)同樣也能被辣椒平部分抵消。辣椒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達(dá)升高，和caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，以及抗凋亡分子Bcl2的表達(dá)水平下降等有關(guān)。辣椒素作為潛在抗腫瘤藥物具有以下4個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：①辣椒素是天然食材成分，人類(lèi)上千年的實(shí)踐證明其作為食物和藥物的安全性，美國(guó)早在1999年就將辣椒素及其同系物（統(tǒng)稱(chēng)為辣椒素類(lèi)物質(zhì)）引入藥典；②辣椒素通過(guò)TRPV1介導(dǎo)其抗增殖效應(yīng)和促凋亡效應(yīng)，而本研究證實(shí)TRPV1在腎癌細(xì)胞（786-O細(xì)胞）中表達(dá)，有可能成為腎癌治療的新靶標(biāo)；③辣椒素能顯著促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡途徑，其機(jī)制可能為促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達(dá)升高，和caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，以及抗凋亡分子Bcl2的表達(dá)水平下降；④辣椒素在減輕疼痛方面的作用已經(jīng)被肯定［4］，基于這一點(diǎn)可以推斷其對(duì)減輕晚期腎癌患者的疼痛、提高生存質(zhì)量方面也可能具有較大的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，辣椒素可抑制腎細(xì)胞癌786-O細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)有可能受到TRPV1的介導(dǎo)。然而，本研究尚有待完善之處，比如本實(shí)驗(yàn)使用單一細(xì)胞系，僅能證明辣椒素對(duì)單一細(xì)胞有效，而尚不能排除細(xì)胞特異性效應(yīng)。另外，未使用正常腎源性細(xì)胞系作為對(duì)照，無(wú)法強(qiáng)有力證實(shí)藥物對(duì)腫瘤的選擇性殺傷效應(yīng)。因此，在本課題組的進(jìn)一步深入研究中，將對(duì)以上不足作更為細(xì)致的探討。當(dāng)然，進(jìn)一步探討TRPV1在正常腎組織和腎腫瘤組織中的表達(dá)差異模式將對(duì)腎癌靶向治療提供更加可靠的理論依據(jù)。此外，有關(guān)辣椒素衍生物對(duì)腎癌細(xì)胞的抗癌效應(yīng)（包括對(duì)腫瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞周期、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的影響）及辣椒素誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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