周向軍

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

Henderson-Hasselbalch方程在氨基酸鹽兩性解離教學(xué)中的應(yīng)用

周向軍

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

分別以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽酸鹽的兩性解離為例，利用Henderson-Hasselbalch方程對(duì)其不同離子形式的溶液pH、不同離子形式的濃度或相對(duì)比例及緩沖溶液的配置進(jìn)行分析，為進(jìn)一步理解氨基酸鹽的解離過程及相關(guān)計(jì)算提供參考.

Henderson-Hasselbalch;氨基酸鹽;兩性解離

氨基酸的兩性解離不僅是理解蛋白質(zhì)眾多理化性質(zhì)和功能的基礎(chǔ)，同時(shí)也是氨基酸分離和分析的基礎(chǔ)，而氨基酸分離、分析則是氨基酸序列測(cè)定的必要步驟，[1]因此，正確理解氨基酸及其鹽的兩性解離，對(duì)于掌握蛋白質(zhì)分離和分析、序列測(cè)定、結(jié)構(gòu)和功能等具有一定的基礎(chǔ)性作用.由于現(xiàn)有生物化學(xué)[1]和有機(jī)化學(xué)[2]教材對(duì)此部分內(nèi)容的介紹較為模糊，學(xué)生對(duì)Henderson-Hasselbalch(HH)方程在不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對(duì)比例及緩沖溶液的配置中的應(yīng)用存在較大困難，因此，有必要對(duì)HH方程在氨基酸鹽兩性解離中的應(yīng)用做進(jìn)一步分析.

HH方程是化學(xué)中有關(guān)酸堿平衡的一個(gè)方程，該方程廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等方面，如緩沖液pH計(jì)算、弱電解質(zhì)的各種離子的離子化程度、臨床血液氣體分析、輸液藥物溶解度與pH的關(guān)系及藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收分布關(guān)系等生物藥劑學(xué)領(lǐng)域.[3-4]李雋群[5]利用HH方程分析氨基酸、肽、蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀態(tài)，進(jìn)一步解釋其兩性解離的原理；同時(shí)該作者認(rèn)為正確理解氨基酸等兩性物質(zhì)帶電狀態(tài)，對(duì)相應(yīng)的電泳圖譜分析、離子交換層析或電泳分離分析均具有一定的指導(dǎo)作用.作者以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽酸鹽的兩性解離為例，利用HH方程對(duì)不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對(duì)比例及緩沖溶液的配置進(jìn)行分析，希望能解決生物化學(xué)教學(xué)中存在的相關(guān)問題，為學(xué)生掌握不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對(duì)比例及緩沖溶液的配置中的應(yīng)用提供幫助.

1　利用HH方程分析0.3mol/L亮氨酸鹽酸鹽溶液、亮氨酸鈉鹽及等電點(diǎn)亮氨酸溶液pH[1]

α-COOH的pK1=2.36，α-NH2的pK2=9.60.

Leu解離簡(jiǎn)式為：

1.1亮氨酸鹽酸鹽溶液pH

亮氨酸鹽酸鹽為二元酸，此時(shí)-COOH的酸性遠(yuǎn)強(qiáng)于質(zhì)子化-N+H3，故溶液的pH幾乎完全取決于-COOH的解離程度，[H+]=[Leu0]，[Leu+]=0.3-[H+].

根據(jù)解離平衡方程，

[H+]≈3.39×10-2mol/L，pH=1.47.同時(shí)也可知，亮氨酸鹽酸鹽在0.3mol/L溶液中解離11.3%.該過程也可簡(jiǎn)化為：即當(dāng)以亮氨酸鹽酸鹽存在時(shí)，[Leu+]?[Leu0]，可認(rèn)為[Leu+]=0.3mol/L，代入上式，得pH≈(pK1+lg0.3)/ 2=1.44.

1.2亮氨酸鈉鹽pH

亮氨酸鈉鹽為二元堿，此時(shí)-NH2的堿性遠(yuǎn)強(qiáng)于-COO-，故溶液的pH幾乎完全取決于-NH2的解離程度，[OH-]=[Leu0]，[Leu-]=0.3-[OH-].

根據(jù)解離平衡方程,

p[OH-]≈2.46，pH=14-2.46=11.54.可知亮氨酸鈉鹽在0.3mol/L溶液中解離1.16%.該過程也可簡(jiǎn)化為：即當(dāng)以亮氨酸鈉鹽存在時(shí)，[Leu-]?[Leu0]，可認(rèn)為[Leu-]= 0.3mol/L，代入上式，得p[OH-]≈-lg(0.3×10-14/10-9.60)/ 2≈2.46，pH=14-2.46=11.54.兩種方法計(jì)算結(jié)果相同，這表明當(dāng)以亮氨酸鈉鹽存在時(shí)，-COO-的堿性幾乎可以完全忽略.

1.3等電點(diǎn)亮氨酸溶液pH

氨基酸的pI是指其解離生成的陽離子和陰離子程度相等時(shí)的溶液pH，也即兩性離子達(dá)到最大值時(shí)的溶液pH，與濃度無關(guān)；而氨基酸水溶液的pH是指氨基酸在水溶液中解離生成的H+的負(fù)對(duì)數(shù)，與濃度有關(guān).[7]利用下列公式[8]計(jì)算，[Leu0]水溶液的pH約為5.98.

2　利用HH方程分析0.25mol/L pH6.4組氨溶液各種離子形式濃度[1]

在pH6.4時(shí)，可認(rèn)為α-COOH完全未被質(zhì)子化，同時(shí)攜帶一個(gè)單位負(fù)電荷，α-NH2被完全質(zhì)子化且攜帶一個(gè)單位正電荷.因此，His的離子形式主要由咪唑基提供.當(dāng)咪唑基被質(zhì)子化時(shí)，His攜帶一個(gè)單位凈正電荷，當(dāng)其不被質(zhì)子化時(shí)，His凈電荷為零. α-COOH的pK1=1.82，咪唑基的pK2=6.0，α-N+H3的pK3=9.17，His解離簡(jiǎn)式為：

根據(jù)HH方程，可得出：

根據(jù)(1)、(2)、(3)和(4)，求得His0=0.179mol/L，His+=0.071mol/L，His2+=1.87×10-6mol/L，His-=3.04× 10-4mol/L.同時(shí)可知，在pH6.4時(shí)，His不同離子形式的比例為His0=71.6%，His+=28.4%，His2+=0.00075%，His-=0.122%.

3　利用HH方程分析0.1mol/L Glu在等電點(diǎn)時(shí)的主要離子濃度

α-COOH的 pK1=2.19，α-NH2的 pK2=9.67,γ-COOH的pK3=4.25，pI=3.22.Glu解離簡(jiǎn)式為：

根據(jù)HH方程，可得出：

根據(jù)(5)、(6)、(7)和(8)，求得Glu+=0.00786mol/L，Glu00.08427mol/L，Glu-=0.00786mol/L，Glu2-=2.79× 10-9mol/L.在Glu等電點(diǎn)時(shí)，不同離子形式的比例為Glu+=7.86%，Glu0=84.27%，Glu-=7.86%，Glu2-=0.01%.

4　利用HH方程分析用含一個(gè)結(jié)晶水的固體組氨酸鹽酸鹽(相對(duì)分子質(zhì)量209.6；咪唑基pKa=6.0)和1mol/LKOH配制1LpH6.5mol/L組氨酸鹽緩沖液[1]

His解離簡(jiǎn)式為：

配制1L pH6.5的濃度為0.2mol/L的組氨酸鹽緩沖液，需要固體組氨酸鹽酸鹽的量為：209.6×0.2= 41.92g.加入KOH中和的H+主要來自His羧基的全部解離和咪唑基的部分解離.pH6.5時(shí)-COOH全部解離，故中和組氨酸鹽酸鹽的-COOH所釋放的H+所需KOH的量等于His的物質(zhì)的量，為0.2mol，即需1mol/ L的KOH溶液200mL；pH6.5時(shí)，咪唑基部分解離，其釋放H+等于生成的His0的物質(zhì)的量，所需KOH的物質(zhì)的量可用HH方程計(jì)算：

5　總　結(jié)

1.3中等電點(diǎn)亮氨酸溶液pH的計(jì)算方法可行，與趙堂[9]的計(jì)算結(jié)果相吻合，即當(dāng)[Leu0]=0.3＞101.70× K1=10-0.66時(shí)，中性氨基酸水溶液pH=pI.趙堂[9]經(jīng)過推導(dǎo)認(rèn)為，中性氨基酸水溶液pH=pI所需滿足的條件：兩性離子的濃度大于101.70×K1.對(duì)于某一種給定的氨基酸，K1為定值，因此，濃度成為決定因素，即同等條件下有較大濃度或較高溶解度的氨基酸，其溶液的pH才有可能等于pI，否則其溶液的pH略大于pI.3的計(jì)算結(jié)果表明酸性氨基酸處于等電點(diǎn)時(shí)主要以兩性離子為主，其兩側(cè)的離子濃度含量較低且相等，Glu2-含量可忽略不計(jì).該結(jié)論同樣適用于中性氨基酸和堿性氨基酸的相應(yīng)分析，這對(duì)于進(jìn)一步從具體事例角度理解酸性氨基酸和堿性氨基酸的pI只選擇兩性離子兩側(cè)的pKa具有一定意義.

以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽為例，利用HH方程分別對(duì)其不同離子形式的溶液pH、不同離子形式的濃度或相對(duì)比例及緩沖溶液的配置進(jìn)行分析.一般可按如下方法進(jìn)行：首先查表獲得各解離基團(tuán)pK，然后根據(jù)可解離基團(tuán)pK的大小，按照pK1＜pK2＜pK3正確書寫氨基酸兩性解離簡(jiǎn)式，即那個(gè)基團(tuán)的pK越小，那個(gè)基團(tuán)先解離.最后根據(jù)HH方程寫出關(guān)系式并分析計(jì)算.

[1]王鏡巖,朱圣庚,徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)[M].3版.北京：高等教育出版社,2002.

[2]汪小蘭.有機(jī)化學(xué)[M].4版.北京：高等教育出版社,2004.

[3]楊左海.Henderson-Hasselbalch方程及其應(yīng)用[J].大學(xué)化學(xué),1997,12(1)：56-59.

[4]曾令澤,高鴻慈,丁禎錄.HH方程在生物藥劑學(xué)中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1985,20(5)：287-290.

[5]李雋群.氨基酸、肽、蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況分析[J].黔西南民族師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2003,(1)：72-77.

[6]南京大學(xué)《無機(jī)及分析化學(xué)》編寫組.無機(jī)及分析化學(xué)[M]. 4版.南京：高等教育出版社,2004,344.

[7]張曙光,肖玉梅,趙士鐸.氨基酸等電點(diǎn)與氨基酸水溶液pH的區(qū)別[J].大學(xué)化學(xué),2005,20(5)：47-51.

[8]彭崇慧,馮建章,張錫瑜,等.定量化學(xué)分析簡(jiǎn)明教程[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社,1997.

[9]趙堂,韓曉霞.中性氨基酸水溶液pH值等于其pI的濃度條件及原因[J].固原師專學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,19(3)：37-39.

〔責(zé)任編輯 高忠社〕

The Application of Henderson-Hassebalch Equation in the Teaching of Amino Acid Salt Amphoteric Dissociation

Zhou Xiangjun
(School of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui Gansu741001,China)

Taking examples of amphoteric dissociation of leucine salt,histidine salt,glutamic acid salt,the paper analyses the ph,concentration,and relative proportion of solution of different types of icon forms,and the allocation of buffered solution with Henderson-Hasselbalch equation,providing references for further understanding of the amino acid salt sissociation process and the relevant calculation.

Henderson-Hasselbalch;amino acid salt;amphoteric dissociation

O6-041

A

1671-1351（2015）05-0118-03

2015-06-11

周向軍（1980-），男，甘肅鎮(zhèn)原人，天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院講師，碩士。