王柱寬

（河北省唐山市玉田縣農(nóng)牧局，玉田064100）

近年，蔬菜的農(nóng)藥殘留問題成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)問題，農(nóng)藥殘留檢測(cè)工作在蔬菜生產(chǎn)基地、蔬菜批發(fā)市場(chǎng)、大型超市普遍開展，而應(yīng)用最普遍的檢測(cè)手段是農(nóng)殘的快速檢測(cè)。酶抑制法因其較高的專一性、靈敏性、準(zhǔn)確性及低成本等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘快速檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際操作過程中，由于多種因素影響，會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題，有時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)為零或抑制率超過100%，造成結(jié)果的誤判或根本無(wú)法判定。下面就酶抑制法農(nóng)殘速測(cè)技術(shù)的原理、操作方法及實(shí)際操作中應(yīng)注意的問題做一介紹。

1 原理

酶抑制率法主要用于檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷類及氨基甲酸酯類兩類農(nóng)藥的殘留情況。其原理是：在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度稱呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物(乙酰膽堿)水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留。結(jié)果判定以酶的被抑制程度 （抑制率）表示。

2 機(jī)型選擇

酶抑制率法農(nóng)殘檢測(cè)儀廠家，根據(jù)單批次同時(shí)檢測(cè)樣品數(shù)量的不同，設(shè)計(jì)出不同的通道類型，常用的有8通道、12通道、24通道、48通道、96通道等。8通道可以同時(shí)檢測(cè)1～7個(gè)樣品，12通道可以同時(shí)檢測(cè)1～12個(gè)樣品，96通道可以同時(shí)檢測(cè)最多92個(gè)樣品，其他通道檢測(cè)儀可以同時(shí)檢測(cè)相應(yīng)的多個(gè)樣品。在選擇機(jī)型時(shí)，要根據(jù)實(shí)際需要，按單批次檢測(cè)的樣品數(shù)量選擇相應(yīng)通道的檢測(cè)儀。如果檢測(cè)數(shù)量比較少，可以選擇通道數(shù)比較少的檢測(cè)儀。如果使用相差懸殊通道數(shù)的檢測(cè)儀，一是利用八道移液器時(shí)，技術(shù)操作手法要求比較高，若操作不慎，精準(zhǔn)度會(huì)受到影響，二是造成檢測(cè)試劑不必要的浪費(fèi)。相反，如果用單批次處理的樣品較多時(shí)，選用很少的檢測(cè)通道，就會(huì)造成批內(nèi)操作時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致誤差。

3 試劑配制

3.1 pH8.0緩沖液

分別取11.9g無(wú)水磷酸氫二鉀與3.23g磷酸二氫鉀，用1000ml蒸餾水溶解。

3.2 顯色劑

分別取160g二硫代二硝基苯甲酸 （DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20ml緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。

3.3 底物

取25.0mg硫代乙酰膽堿。加3.0ml蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^兩周。

3.4 乙酰膽堿酯酶

根據(jù)酶的活性情況，用緩沖液溶解，3min的吸光度變化△A值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期不超過4天。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，一般都是采用儀器生產(chǎn)廠家提供的與檢測(cè)儀匹配的檢測(cè)試劑，在使用時(shí)按照其使用說明書操作即可

4 檢測(cè)步驟

4.1 樣液制備

4.1.1 樣品處理選取有代表性的蔬菜樣品，擦掉表面泥土，葉菜類蔬菜剪成1cm左右見方碎片2g，瓜果類、塊根 （莖）類取表皮2g，放入提取瓶中，用可調(diào)移液器加入10ml緩沖液后，放入多用可調(diào)速振蕩器中，震蕩提取兩分鐘，靜置3～5分鐘。

4.1.2 若浸提液清澈無(wú)色或顏色較淺，用移液管轉(zhuǎn)移至離心管中做待測(cè)液；若浸提液混濁，可用移液管吸取浸提液至離心管0.5ml刻度線，放入微型離心機(jī)中離心至上層液清澈后，取出，放在離心管架上做樣液；再?zèng)]有離心機(jī)的情況下，也可以采取過濾的方式替代。

4.1.3 若浸提液色素干擾嚴(yán)重，將浸提液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)提取瓶中，加入0.1～0.5g活性炭 （根據(jù)顏色深淺調(diào)整），放入多用可調(diào)速振蕩器，震蕩5～6分鐘 （脫色時(shí)間可根據(jù)脫色情況適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短），取出靜置5～10分鐘，用移液管吸取上層液至離心管0.5m刻度線，放入微型離心機(jī)中離心至上層液清澈后，取出，放在離心管架上做樣液 （樣液中不能殘留活性炭，若有殘留，需進(jìn)行二次離心處理）。

4.1.4 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇雞番茄汁液中，含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株 （體）浸提，避免次生物物質(zhì)干擾。

4.1.5 使用不同的儀器，在樣液的配制過程會(huì)略有不同，有的取1g樣品，有的取2g樣品，但是與之對(duì)應(yīng)加入的緩沖液分別為5ml和10ml，比例相同。

4.2 對(duì)照液配制

對(duì)照液直接移取緩沖液即可。

4.3 測(cè)試

4.3.1 對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5ml緩沖液，再加入0.1ml酶液、0.1ml顯色劑，搖勻后于37℃放置15分鐘以上 （每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.1ml底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3分鐘的吸光度變化值△A。

4.3.2 樣品溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5ml樣品提取液，其他操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)3分鐘的吸光度變化值△A。

4.3.3 利用多通道移液器移取酶試劑、顯色劑及底物時(shí)，需要將試劑倒入V型槽中取用。用移液器在測(cè)試的微孔板孔內(nèi)分別加入酶20ul。再用移液器加入對(duì)照緩沖液或樣品處理液250ul.注：緩沖液必須加入微孔板的第一列： （48、96通道為A1-H1；32通道為1A-8A）。將加入試劑及樣品的微孔板放入儀器，按上下鍵選擇 “啟動(dòng)振板”菜單后按 “確認(rèn)”鍵啟動(dòng)振板，將酶和樣品混勻。振板結(jié)束后，讓酶試劑與緩沖液或樣品液的混合液靜置反應(yīng)10分鐘。然后用移液器往測(cè)試微孔板內(nèi)分別加入顯色劑10ul、底物10ul，立即放入儀器測(cè)量。如果儀器開機(jī)后還沒有進(jìn)行對(duì)照測(cè)量，則需要進(jìn)行一次對(duì)照測(cè)量。按 “對(duì)照”鍵進(jìn)行測(cè)量時(shí)，儀器自動(dòng)將第一列作為對(duì)照液，其他行作為樣品液。測(cè)量結(jié)束后儀器自動(dòng)保存當(dāng)前的對(duì)照值，下一次樣品測(cè)量時(shí)就可以不用繼續(xù)進(jìn)行對(duì)照測(cè)量。注：各通道以本列各自對(duì)照液的△A為對(duì)照計(jì)算樣品抑制率。若已完成各通道的對(duì)照測(cè)試，微孔板上所有孔都可作為樣品測(cè)量，放入儀器后，按 “樣品”鍵啟動(dòng)測(cè)量，若設(shè)置測(cè)量前振板，則儀器在啟動(dòng)測(cè)量后先按照設(shè)置的振板時(shí)間進(jìn)行振板后進(jìn)行讀板操作。

5 結(jié)果的表述計(jì)算

5.1 結(jié)果計(jì)算

5.2 結(jié)果判定

結(jié)果以酶的被抑制程度 （抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率﹤50%時(shí)，蔬菜相對(duì)安全；當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有高劑量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，結(jié)果為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)兩次以上再確認(rèn)。

對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可用其他方法進(jìn)一步確定農(nóng)藥的品種和含量。

6 檢測(cè)過程中應(yīng)該注意的問題

6.1 樣品處理

不同的果蔬品種，在樣液制備的過程中，要區(qū)別對(duì)待，盡最大可能降低蔬果中的次生物、色素等物質(zhì)的干擾。

6.2 儀器提前預(yù)處理

大部分儀器在進(jìn)行檢測(cè)前有一段預(yù)啟動(dòng)過程，這步不能省略，要嚴(yán)格按照操作規(guī)程檢測(cè)。

6.3 檢測(cè)環(huán)節(jié)

緩沖液的配制中，要用蒸餾水或?qū)嶒?yàn)室用純水，不能夠用市場(chǎng)上飲用純凈水代替。

檢測(cè)試劑都有嚴(yán)格的儲(chǔ)存條件，要嚴(yán)格按照說明儲(chǔ)存，尤其注意的是試劑在郵遞過程中保護(hù)措施要到位，避免試劑失效。掌握好試劑的有效期，一般為1年。

配制好的試劑，要在指定的條件保存，酶試劑配制好后一周用完，顯色劑、底物不超過1個(gè)月。

檢測(cè)時(shí)，試劑要提前從冰箱取出，并且恢復(fù)室溫下才能使用，如果試劑渾濁，要先搖勻后使用。

檢測(cè)的環(huán)境條件，室外溫度過高或過低都不能檢測(cè)，室內(nèi)的溫度要控制在18～32℃。

檢測(cè)液加入底物后，要立即放入比色槽或處理槽進(jìn)行測(cè)試。

每一次儀器重啟檢測(cè)時(shí)，都需要重新測(cè)量對(duì)照。

當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3分鐘的吸光度變化△A0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照時(shí)間一致才有可比性。

膽堿酯酶空白對(duì)照溶液3分鐘的吸光度變化△A0值＜0.3的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。

進(jìn)行對(duì)照測(cè)量時(shí)，1分鐘對(duì)照吸光度變化△A應(yīng)在0.1以上，3分鐘對(duì)照吸光度變化△A應(yīng)在0.3以上，否則該酶試劑不能繼續(xù)使用。

6.4 移液過程

移液器使用時(shí)，必須遵循器具專用原則：吸取酶、顯色劑、底物的移液器貼上專用標(biāo)簽，移取試劑時(shí)一一對(duì)應(yīng)使用，避免混用污染試劑。

試劑使用時(shí)，必須遵循只出不進(jìn)原則：從酶、顯色劑、底物試劑瓶中移取處的試劑，不得返回原試劑瓶中，以免污染原試劑。

用8通道移液器移取酶試劑、顯色劑及底物時(shí)，需要將試劑倒入V型槽中取用。在移取過程中，掌握好手法，槍頭要垂直對(duì)準(zhǔn)，不能傾斜，必須保證各道移取的試劑量相同。

對(duì)照用緩沖液必須加入微孔板的第一列： （48、96通道為A1-H1；32通道為1A-8A）。

6.5 結(jié)果分析

測(cè)量結(jié)果抑制率A%為 “……”，表示測(cè)量結(jié)果無(wú)效。請(qǐng)檢查是否是以下原因引起：①試劑從冰箱取出后，未恢復(fù)至室溫進(jìn)行對(duì)照測(cè)試；②對(duì)照測(cè)試時(shí)間與樣品測(cè)試時(shí)間相隔太久，導(dǎo)致對(duì)照與樣品測(cè)試溫度條件相差較大；③被測(cè)試樣品色素干擾較嚴(yán)重；④反應(yīng)試劑取用量是否準(zhǔn)確。另外，其他非測(cè)試孔如空白的孔位可能也會(huì)出現(xiàn)“……”。