董金星，楊夢(mèng)嬌，陳小芳，周亞林，周金燕，陶雅圓，崔杰玉，謝 越

(安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

EM菌是主要菌種是以乳酸菌、光合細(xì)菌、酵母菌、乙酸菌為主的微生物復(fù)合而成的一種微生活菌制劑[1]，其作為功能性微生物已經(jīng)用于養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)、污水及廢棄物處置等多個(gè)方面[2]，但如何使用適當(dāng)?shù)妮d體使EM菌充分發(fā)揮功效一直是研究的難點(diǎn)。生物炭是生物質(zhì)在缺氧和相對(duì)溫度“較低”(＜700℃)條件下熱解形成的產(chǎn)物[3－4]，主要由有芳香烴和單質(zhì)炭或具有石墨結(jié)構(gòu)的炭組成，含有60%以上的碳元素，其作為肥料緩釋載體、土壤改良劑、污染物修復(fù)、減少碳排放量等方面近些年來受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5－6]。生物炭孔隙度發(fā)達(dá)和比表面積巨大，可以作為優(yōu)良的功能性微生物載體[7]。但生物炭作為EM菌的功能性微生物載體方面的研究卻鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)研究了生物炭作為EM菌載體的承載能力，利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)其進(jìn)行研究，優(yōu)化生物炭投加量、菌液濃度、振蕩時(shí)間、吸附溫度等關(guān)鍵影響因子，探討生物炭作為功能性微生物載體的可行性和最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生物炭:所用生物炭為自制稻殼生物炭，將稻殼放入剛玉坩堝內(nèi)壓緊加蓋，用鋁箔紙包裹嚴(yán)實(shí)后放入馬弗爐內(nèi)，500℃下烘制2h，即制得稻殼生物炭[8]。EM 菌培養(yǎng)基組成為:紅糖100g，尿素1g，NaCl 1g，1L蒸餾水，溶解后調(diào)整pH至7.0±0.2。平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基組成:胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15g，1L 蒸餾水，溶解后調(diào)整 pH7.0 ±0.2，分裝錐形瓶后，121℃高壓滅菌滅菌15min[9]。無菌生理鹽水:取8.5g NaCl溶于1L蒸餾水中，121℃高壓滅菌滅菌15min。EM菌種采購(gòu)自河南中廣集團(tuán)，菌種為黃褐色干粉狀復(fù)合型菌劑，由雙岐菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、放線菌、醋酸菌等組成。紅糖購(gòu)于安徽省鳳陽縣某超市;尿素、NaCl、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂等藥劑均為分析純。HZ500L恒溫?fù)u床(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司);GI54T高壓滅菌鍋(ZEALWAY);DNP－9272－1A恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備待測(cè)EM菌液 將EM菌種干粉接種于EM菌培養(yǎng)基，置于密閉塑料瓶中，36±1℃、200 r/min，每日放氣一次，振蕩培養(yǎng)48 h，即為活化EM菌液。再將活化EM菌液與EM培養(yǎng)基以體積比1∶19的比例，36℃恒溫、160 r/min振蕩，每日開蓋放氣一次，振蕩培養(yǎng)72h后即為待測(cè)EM菌液。

1.2.2 不同生物炭投加量對(duì) EM 菌吸附效果的影響 各取 0.40g、0.80g、1.20g、1.60g、2.00g、2.40g 生物炭，另取0g記為CK，加入250mL三角燒瓶?jī)?nèi)，分別加入10mL待測(cè)EM菌液和90mL無菌水，25℃、160 r/min振蕩30min，取上清液測(cè)定EM菌CFU值，以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值，測(cè)定方法見1.2.6。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 生物炭對(duì)不同濃度EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測(cè)EM菌，分別稀釋2倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍，加入2g生物炭，另取0g記為CK，加入250mL三角燒瓶?jī)?nèi)，分別加入10mL待測(cè)EM菌液和90mL無菌水，25℃、160 r/min振蕩30min，取上清液測(cè)定EM菌CFU值，以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值，測(cè)定方法見1.2.6。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 不同振蕩時(shí)間生物炭對(duì)EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測(cè)EM菌、40mL無菌水，分別加入6 個(gè)250mL 三角燒瓶?jī)?nèi)，加入2g生物炭，25℃、160 r/min 振蕩 0min、30min、60min、90min、120min、150min，另取0g記為CK，加入250mL三角燒瓶?jī)?nèi)，取上清液測(cè)定EM菌CFU值，以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值，測(cè)定方法見1.2.6。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 不同溫度下生物炭對(duì)EM菌吸附效果的影響 各取10mL待測(cè)EM菌、40mL無菌水，分別加入5個(gè)250mL三角燒瓶?jī)?nèi)，加入2g生物炭，分別置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，160 r/min振蕩60min，另取0g記為CK，加入250mL三角燒瓶?jī)?nèi)，取上清液測(cè)定EM菌CFU值，以CK的CFU值減去不同處理樣品CFU值即為被生物炭吸附的EM菌CFU值，測(cè)定方法見1.2.6。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 EM菌CFU值測(cè)定方法 在超凈工作臺(tái)內(nèi)以無菌操作將待測(cè)樣取1mL用無菌生理鹽水稀釋至104、105兩個(gè)稀釋倍數(shù)，各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿加入15mL～20mL尚未凝固的平板計(jì)數(shù)瓊脂，混勻，凝固后在瓊脂表面再覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基(約4mL)，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36±1℃培養(yǎng)48h±2h后記錄稀釋倍數(shù)和相對(duì)應(yīng)的菌落數(shù)量，即為菌落形成單位(以CFU表示)。

1.3 最佳吸附效果選擇

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以生物炭投加量、EM菌濃度、振蕩時(shí)間、吸附溫度4個(gè)條件作為參考因素，設(shè)計(jì)正交設(shè)計(jì)因素與水平考察，見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平考察表Table 1 Orthogonal design factor and level survey

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸附條件的確定

2.1.1 投加生物炭量的確定 試驗(yàn)1設(shè)計(jì)單因素變量為生物炭投加量，加入不同重量生物炭吸附處理后，取上清液稀釋至合適倍數(shù)，分別接入計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，經(jīng)過48h培養(yǎng)后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，從圖1可知，生物炭吸附的EM菌的數(shù)量隨著生物炭的增加而增加，加入2.4g生物炭吸附的EM菌CFU數(shù)量最多，達(dá)到2.9×107CFU，相比投加量為0.4g時(shí)吸附的EM菌數(shù)量增加了93.3%，生物炭投加量與EM菌吸附量呈正相關(guān)性。當(dāng)生物炭投加量0.4g時(shí)，其吸附的CFU數(shù)為1.5×107CFU，但當(dāng)投加量增加一倍至0.8g時(shí)，其吸附的CFU僅為1.7×107CFU，增幅僅為13.3%。根據(jù)圖2可知，單位生物炭吸附效果最好的是加入0.4g時(shí)，其吸附量為3.8×107CFU/g。隨著生物炭投加量的增加，單位生物炭吸附量在投加至2.4g時(shí)逐漸減少為1.2×107CFU/g。由投加量0.4g增加至0.8克時(shí)，其單位生物炭吸附量大幅降低43.3%，但此后降幅顯著減小，當(dāng)投加量從2.0g提升至2.4g時(shí)，單位生物炭吸附量?jī)H降低7.1%，生物炭投加量與單位生物炭吸附量呈負(fù)相關(guān)。

2.1.2 菌液濃度確定 試驗(yàn)2設(shè)計(jì)單因素變量為不同濃度EM菌，原EM菌液濃度為4.5×107CFU/mL，加入不同倍數(shù)純水稀釋處理后，取上清液稀釋至合適倍數(shù)，分別接入計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，經(jīng)過48h培養(yǎng)后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。由圖3可知，生物炭吸附效果最好的是稀釋2倍，生物炭可吸附的EM菌達(dá)到2.3×107CFU/g，隨著菌液濃度的降低吸附效果降低，當(dāng)稀釋至20倍時(shí)，生物炭吸附量?jī)H0.3×107CFU/g，僅為稀釋2倍時(shí)的10%。稀釋倍數(shù)與EM菌吸附量呈負(fù)相關(guān)。劉慶莉[10]等人研究根瘤菌在草炭和蛭石作為載體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以草炭和蛭石作為根瘤菌載體，低濃度的根瘤菌液接入更能發(fā)揮作用，而以液體作為根瘤菌載體，根瘤菌接入濃度較高才能發(fā)揮作用。

2.1.3 振蕩時(shí)間的確定 從圖4可知，試驗(yàn)3設(shè)計(jì)單因素變量為不同振蕩時(shí)間，當(dāng)振蕩時(shí)間為0min時(shí)，吸附EM菌僅為0.3×107CFU/g，150min生物炭吸附的EM菌已達(dá)到2.9×107CFU/g，振蕩30min較振蕩0min生物炭吸附的EM菌增加了463%，但隨著振蕩時(shí)間的增加，振蕩90min后吸附量增加已不顯著，振蕩150min較振蕩120min吸附量?jī)H增加3.2%，振蕩120min較振蕩90min吸附量?jī)H增加4.5%。其原因是生物炭表層有著大量多空隙結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)，孔道效應(yīng)也較明顯，利于吸附過程的進(jìn)行。在吸附過程初期，吸附效率較為迅速，但隨著吸附時(shí)間增加，EM菌大量聚集在生物炭的微孔和表面，使得生物炭吸附位不斷減小，因此吸附速率逐漸降低。此前已有許多學(xué)者對(duì)振蕩吸附時(shí)間作過研究，沈巖柏[11]等人研究當(dāng)吸附載體為硅藻土?xí)r，振蕩20min時(shí)已達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，馬萬征[12]等研究當(dāng)活性炭吸附含鉻廢水時(shí)，150min可達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，而戴世華[13]等人研究的使用活性炭脫色工藝研究在70min即可達(dá)到最佳。本研究與其可能由于試驗(yàn)載體材質(zhì)的不同，振蕩90min后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2.1.4 吸附溫度的確定 試驗(yàn)4單因素變量為不同吸附溫度，從圖5可知，當(dāng)吸附溫度為15℃時(shí)，生物炭吸附的EM菌僅為1.8×107CFU/g，當(dāng)吸附溫度上升至35℃時(shí)，生物炭吸附量達(dá)最大值2.6×107CFU/g，生物炭吸附量提高了44.4%。但當(dāng)吸附溫度上升至40℃時(shí)，生物炭吸附量降低為2.3×107CFU/g，降幅為11.5%，其原因可能為有部分EM菌超過35℃后開始死亡。此前許多學(xué)者對(duì)吸附溫度與吸附量對(duì)菌群的影響進(jìn)行研究，沈巖柏[12]等人的研究硅藻土對(duì)諾卡氏菌的吸附作用，室溫下即可達(dá)到較好的吸附效果，但與趙穎[14]等人研究EM菌則在35℃時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，其原因可能因載體或菌種不同其對(duì)吸附溫度產(chǎn)生的差異表現(xiàn)。

2.2 最佳吸附條件的選擇

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，并考慮到在實(shí)際應(yīng)用過程中對(duì)EM菌群最大總吸附數(shù)量的要求，選取1.6g、2.0g、2.4g作為正交試驗(yàn)3個(gè)因素水平;選取稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋5倍作為正交試驗(yàn)的個(gè)因素水平;選取60min、90min、120min作為正交試驗(yàn)3個(gè)因素水平，選擇30℃、35℃、40℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)因素水平，以正交因子水平表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)，見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Orthogonal experimental results tables

由表2的極差分析可知，4個(gè)因素中對(duì)生物炭吸附EM菌效果的影響大小主次順序依次為:A＞B＞C＞D，即生物炭投加量(A)＞菌液濃度(B)＞振蕩時(shí)間(C)＞吸附溫度(D)，生物炭投加量和菌液濃度對(duì)生物炭吸附EM菌影響較大。由正交試驗(yàn)K值可推導(dǎo)出，最優(yōu)吸附條件為A3B1C3D3，但與正交試驗(yàn)表中最優(yōu)吸附條件A3B1C3D2不相符，對(duì)組合A3B1C3D3進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，其吸附的生物炭為3.8×107CFU/g，大于正交試驗(yàn)中組合A3B1C3D2的3.6×107CFU/g，因此生物炭吸附EM菌最佳吸附條件為A3B1C3D3，即生物炭投加量2.4g、菌液稀釋倍數(shù)2倍、振蕩120min、吸附溫度40℃、生物炭吸附的CFU值最高達(dá)到3.8×107CFU/g。

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)生物炭吸附重金屬的研究較多，但對(duì)其作為吸附EM菌的載體研究鮮見報(bào)道。本文研究生物炭作為EM菌載體，生物炭投加量、菌液濃度、振蕩時(shí)間、吸附溫度等四個(gè)影響因素對(duì)其吸附效果的影響，獲得如下結(jié)論:生物炭對(duì)EM菌有良好的吸附效果，生物炭吸附EM菌量與生物炭投加量呈正相關(guān)，但其吸附效率與生物炭投加量呈負(fù)相關(guān);與EM菌的濃度呈正相關(guān);與菌液稀釋倍數(shù)呈負(fù)相關(guān);與振蕩吸附時(shí)間呈正相關(guān)，與吸附溫度在15℃到35℃內(nèi)呈正相關(guān)，但溫度達(dá)到40℃吸附效率有所降低。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，生物炭吸附EM菌主要影響因素為生物炭投加量＞菌液濃度＞振蕩時(shí)間＞吸附溫度;吸附10mL濃度為4.5×107CFU/mL的EM菌液其最佳條件為生物炭投加量2.4g、菌液稀釋倍數(shù)2倍、振蕩120min、吸附溫度40℃。本研究結(jié)果揭示了生物炭可以作為EM菌劑優(yōu)良載體，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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