程勛東，隋益虎

(安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

辣椒(Capsicum spp.)種植面積居我國(guó)蔬菜作物第二位，是市場(chǎng)上最為常見(jiàn)的蔬菜之一[1]。常見(jiàn)辣椒病害主要有炭疽病、疫病、病毒病等[2]，尤其炎熱潮濕的氣候條件有利炭疽病發(fā)生，發(fā)病后會(huì)造成大量落葉和爛果，通常減產(chǎn)20% ～50%，嚴(yán)重影響辣椒商品性[3]。據(jù)報(bào)道各地辣椒炭疽病致病的病原菌有一定的差異，主要有辣椒叢刺盤(pán)孢菌(Vermicularia capsici Syd)、辣椒盤(pán)長(zhǎng)孢菌(G.piperatum Ell.et EV)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)等[4]，本研究通過(guò)對(duì)本地辣椒炭疽菌進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)行生物特性研究，為辣椒果實(shí)炭疽病的栽培預(yù)防及防治提供基礎(chǔ)性資料，以期提高辣椒果實(shí)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表現(xiàn)為典型炭疽病癥狀的辣椒果實(shí)取自安徽科技學(xué)院種植科技園3號(hào)溫室。

1.2 病原菌的分離和純化

首先將試驗(yàn)材料用自來(lái)水將表面的泥漬等洗凈后晾干，接著用70%的酒精進(jìn)行表面消毒30 s，然后用0.1%的氯化汞將材料消毒6 min，迅速用滅菌水沖洗3次。用手術(shù)刀片于果實(shí)表面切口，用接種針挑取內(nèi)部病害部位病原菌接種至PDA培養(yǎng)基(組份為葡糖糖20 g、瓊脂20 g、去皮土豆200 g，蒸餾水1000 mL，煮沸30 min，自然pH值)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長(zhǎng)狀況，包括菌落的大小、形狀、顏色等形態(tài)特征，挑取單菌落在培養(yǎng)基上28℃進(jìn)行純培養(yǎng)，并將各菌株劃線純培養(yǎng)于PDA試管斜面保存，為下列試驗(yàn)提供原始菌株。

1.3 病原菌產(chǎn)孢誘導(dǎo)及鑒定

為了鑒定材料中分離得到的病原菌，首先對(duì)其誘導(dǎo)產(chǎn)孢，根據(jù)唐景美[5]等對(duì)辣椒炭疽病菌生物學(xué)特性以及分生孢子的特性研究，設(shè)計(jì)了幾種誘導(dǎo)產(chǎn)孢的方法(如表1)，其中PDA+辣椒培養(yǎng)基為上述PDA培養(yǎng)基中添加辣椒葉片50 g。待菌落產(chǎn)孢后，觀察菌落的形態(tài)特征，并利用數(shù)碼顯微鏡(Motic，BA210)觀察孢子和孢子梗的形態(tài)特點(diǎn)并拍照，進(jìn)行病原菌初步鑒定。

表1 促進(jìn)病原菌產(chǎn)孢的處理方式Table 1 Treatment combinations of inducing pathogen to spore

1.4 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響

將直徑為4 mm的菌齡相同生長(zhǎng)旺盛的菌餅無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基平板的中央，分別置于15、20、25、30、35和40℃溫度梯度下連續(xù)培養(yǎng)，每種處理3次重復(fù)。5 d后采用十字相交的方式測(cè)量各菌落的直徑并計(jì)算3次重復(fù)的平均值。比較不同溫度條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)速率。

1.5 培養(yǎng)基成分對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響

將大蒜、芥菜、小白菜、番茄、辣椒5種不同種類(lèi)蔬菜的葉片洗凈晾干后各自稱(chēng)取5 g，分別與土豆20 g，葡糖糖2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL制成相應(yīng)的PDA復(fù)合培養(yǎng)基，對(duì)照培養(yǎng)基成分為土豆25 g(去皮)，葡糖糖2 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL。將直徑為4 mm菌齡相同生長(zhǎng)旺盛的菌餅無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到6種不同成分培養(yǎng)基平板的中央，置于28℃條件下連續(xù)培養(yǎng)，每種處理3次重復(fù)，菌落直徑測(cè)量方法同上。比較含不同種類(lèi)蔬菜成分的培養(yǎng)基中病原菌菌絲生長(zhǎng)速率。

取紫色辣椒7036、9007－1、1127、1121P －3和綠色辣椒1123G －3、1126－2、1116－2、111SL －1共8種不同品種的辣椒葉片洗凈晾干，利用隋益虎等[6]紫色辣椒葉片色素的優(yōu)化提取方法，比較不同品種辣椒葉片色素的相對(duì)含量。將8個(gè)品種的辣椒葉片洗凈晾干后各稱(chēng)取5 g，分別與土豆20 g(去皮)，葡糖糖2g，瓊脂2g，蒸餾水100 mL，制成相應(yīng)的PDA復(fù)合培養(yǎng)基。以含25 g去皮土豆的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基。將直徑4 mm菌齡相同生長(zhǎng)旺盛的菌餅菌絲面朝下無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到6種含有不同辣椒葉片成分的培養(yǎng)基中央，置于28℃條件下連續(xù)培養(yǎng)，每種處理3次重復(fù)，菌落直徑測(cè)量方法同上。比較含不同品種辣椒成分培養(yǎng)基中病原菌菌絲生長(zhǎng)速率。

1.6 光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響

將直徑為4 mm的菌齡相同生長(zhǎng)旺盛的菌餅菌絲面朝下無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中央，分別置于24 h完全光照、12 h光暗交替、24 h完全黑暗3種光照條件28℃條件下連續(xù)培養(yǎng)，每種處理3次重復(fù)，菌落直徑測(cè)量方法同上。比較不同光照條件下病原菌菌絲生長(zhǎng)速率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所得的數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行方差分析和SPSS 16.0進(jìn)行單因素多重比較處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢及鑒定

經(jīng)過(guò)分離純化的病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d后，觀察可知各菌落形態(tài)基本一致，菌落直徑約為66.67 mm，邊緣較圓整，菌落呈同心圓形狀，生長(zhǎng)初期菌絲為白色，后期變?yōu)榛野咨翜\褐色(圖1)。誘導(dǎo)產(chǎn)孢試驗(yàn)表明，病原菌在PDA培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)不產(chǎn)孢子或產(chǎn)生極少量孢子，在光暗交替以及先低溫后高溫培養(yǎng)下能促進(jìn)產(chǎn)孢，而其他處理組均未觀察到明顯的孢子產(chǎn)生?？赡苁且?yàn)椴焕臏毓猸h(huán)境條件或不當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)元素比例，能促進(jìn)該病原菌產(chǎn)生孢子。

顯微鏡下觀察病原菌分生孢子和孢子梗的特征，分生孢子呈圓柱狀，無(wú)色，部分孢子兩端為弧形，部分孢子一端尖一端弧形，孢子梗直立呈短圓柱形，具有2～4個(gè)隔膜(圖2)。根據(jù)這些病原菌的形態(tài)特征，參考鄭建秋[7]、吳文平[4]和陸家云[8]等的描述，初步鑒定可知分離純化的病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

2.2 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

在所設(shè)置的6種溫度條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d發(fā)現(xiàn)，在15～35℃范圍內(nèi)病原菌菌絲均能生長(zhǎng)。但是不同的溫度條件下，菌落直徑大小各不相同。在15～25℃范圍內(nèi)，菌落直徑和溫度高低呈正相關(guān)關(guān)系;在25～35℃范圍內(nèi)，菌落直徑和溫度高低呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;40℃高溫對(duì)該菌菌絲的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用;25℃時(shí)菌落直徑最大。可知6個(gè)溫度梯度中，25℃為該病原菌的最適生長(zhǎng)溫度，最適溫度范圍為25～30℃，而菌絲能否生長(zhǎng)的高溫臨界溫度在35～40℃之間(表2)。

表2 不同溫度條件下炭疽菌落的直徑Table 2 Diameter of the colony under the different temperature gradient

2.3 培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

2.3.1 不同種類(lèi)蔬菜成分對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 供試的含有不同蔬菜成分的PDA固體培養(yǎng)基上，該病原菌在含有芥菜和大蒜葉片成分的培養(yǎng)基中菌落直徑最小，與含有辣椒、小白菜和番茄3種葉片成分的培養(yǎng)基上的菌落直徑相比有顯著差異;在含有大蒜成分的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況顯著差于在含有其他4種成分培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況;而含有辣椒、小白菜、番茄葉片成分的培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況沒(méi)有顯著差異(表3)。

表3 含有不同蔬菜葉片成分的培養(yǎng)基中菌落的直徑Table 3 Diameter of the colony growing in the PDA－based culture medium supplemented with different composition of various vegetables

2.3.2 不同品種辣椒成分對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 葉片色素的吸光度值測(cè)定表明，不同品種的辣椒中色素含量差別很大，紫色辣椒花青素含量較普通綠色辣椒高，但含有不同辣椒葉片成分的培養(yǎng)基中，病原菌菌絲均能夠正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)5 d后菌落直徑?jīng)]有顯著差異，各處理菌落的形態(tài)較為一致(表4)。

表4 含有不同花青素成分的辣椒品種培養(yǎng)基中菌落的直徑Table 4 Diameter of the colony growing in the PDA－based culture medium supplemented with different content of anthocyanin in chilli pepper varieties

2.4 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

在不同的光照條件下，病原菌菌絲均能夠生長(zhǎng)，各處理菌落直徑和菌絲顏色較為一致。24h完全光照、12h光暗交替和 24h完全黑暗處理菌落直徑分別為 67.50 ±2.12、66.67 ±1.53和 66.00 ±2.00(mm)，方差分析表明3種光照處理下菌落直徑大小無(wú)顯著性差異，可見(jiàn)病原菌菌絲的生長(zhǎng)不受光照條件的影響。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)辣椒炭疽病果實(shí)中分離得到的病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果表明經(jīng)分離純化得到的菌株均為膠孢炭疽菌，該病原菌在28℃下培養(yǎng)僅能產(chǎn)生少量的孢子，而在光暗交替或者冷熱交替條件下培養(yǎng)，能產(chǎn)生大量的孢子。病原菌菌絲的生長(zhǎng)不受光照條件的影響。

溫度在15～35℃之間病原菌菌絲均可以生長(zhǎng)，在25～30℃之間菌絲生長(zhǎng)速率相較其它培養(yǎng)溫度最快，25℃時(shí)速率最大即為最適溫度，35～40℃為菌絲生長(zhǎng)高溫臨界溫度。該試驗(yàn)結(jié)果和張海英等[9]對(duì)引起草莓上膠孢炭疽病以及范曉龍等[10]對(duì)紅豆杉上的膠孢炭疽菌的研究結(jié)果基本一致。由于試驗(yàn)當(dāng)中溫度梯度范圍有限，只獲得該病原菌的最適生長(zhǎng)溫度范圍和高溫臨界溫度范圍，可通過(guò)在25～30℃之間以及15℃以下設(shè)置系列濃度梯度，以更精確地獲知該病原菌的生長(zhǎng)最適溫度和低溫臨界溫度。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蒜和芥菜對(duì)膠孢炭疽菌生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用。有研究[11－13]表明大蒜中含有大蒜素，它是由大蒜體內(nèi)的大蒜酶催化大蒜氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，能夠抑制或殺滅多種病菌。芥菜中含有揮發(fā)性的芥子油成分，該成分具有一定的刺激性，可能與抑菌作用有關(guān)，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[14]。由于本研究在培養(yǎng)基滅菌過(guò)程中，會(huì)使得部分大蒜素和芥子油分解或揮發(fā)，從而削弱了二者的抑菌殺菌作用。若采用組織培養(yǎng)的方法獲得大蒜和芥菜的無(wú)菌苗，無(wú)菌操作研磨并提取大蒜素和芥子油加入到供試培養(yǎng)基當(dāng)中，則二者對(duì)該病原菌的抑制作用可能更強(qiáng)。同時(shí)，二者在大面積保護(hù)地或露地栽培中是否也有良好的抑菌作用，還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

不同品種的辣椒葉片花青素的含量各不相同，7036、9007－1、1127、1121P－3等4個(gè)品種為紫色辣椒，紫色辣椒的莖、葉、花、幼果等器官中因富含花青素均表現(xiàn)為紫色，與普通的綠色辣椒相比，紫色辣椒植株表現(xiàn)出許多優(yōu)良特性，比如抗病、抗逆性強(qiáng)[15－16]等，這可能與其中包含較高含量花青素有關(guān)。但在含有紫色辣椒成分的培養(yǎng)基中并未表現(xiàn)出對(duì)病原菌的抑制作用，可能與培養(yǎng)基滅菌的過(guò)程中該成分高溫高壓分解有關(guān)。因此尚需通過(guò)組織培養(yǎng)獲得無(wú)菌植株，在無(wú)菌操作下獲取研磨液再加入高溫高壓滅菌后的培養(yǎng)基中，才能確定紫色辣椒中花青素組分是否對(duì)該病原菌具有抑制作用。

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