王 寧，史洪巖，程 敏，孫嬰寧，李 輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

過表達HOPX基因?qū)﹄u脂肪生長發(fā)育重要基因表達的影響

王 寧，史洪巖，程 敏，孫嬰寧，李 輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為揭示HOPX基因在雞脂肪生長發(fā)育中的作用，研究采用Real-time RT-PCR和啟動子熒光素酶報告基因技術(shù)，分析過表達HOPX基因?qū)﹄u脂肪生長發(fā)育重要基因的表達及其啟動子活性的影響。結(jié)果表明，與空載體對照組（pCMV-HA vector）相比，HOPX基因能夠促進A-FABP和PPARγ基因表達及其啟動子活性，抑制KLF 7基因表達及其啟動子活性，但對FAS基因表達及其啟動子活性沒有影響。研究結(jié)果顯示，過表達HOPX基因可能促進雞前脂肪細胞分化。

HOPX基因；雞；脂肪細胞分化；發(fā)育

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-4-30 14:30:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150430.1430.004.html

王寧,史洪巖,程敏,等.過表達HOPX基因?qū)﹄u脂肪生長發(fā)育重要基因表達的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(5):44-50.

Wang Ning,Shi Hongyan,Cheng Min,et al.Effect ofHOPXoverexpression on expression of the important developmental genes in chicken adipose[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(5):44-50.(in Chinese with English abstract)

前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化過程受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，既有促進脂肪細胞分化的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，也有抑制脂肪細胞分化負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，脂肪細胞分化是正、負轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子共同作用的結(jié)果。PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ）和C/EBPα（CCAAT/enhancer binding pro?teinα）是脂肪細胞分化關(guān)鍵基因，兩者相互激活轉(zhuǎn)錄并協(xié)調(diào)作用，促進脂肪細胞分化。隨前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，PPARγ和C/EBPα表達量逐漸升高[1]。KLF 7（Krüppel-like factor 7）是脂肪細胞分化早期表達基因，是脂肪細胞分化負調(diào)控因子，能抑制C/EBPα基因啟動子活性[2]。脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）基因和脂肪酸結(jié)合蛋白（Adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP）基因是脂肪細胞分化晚期表達的基因，其表達量在脂肪細胞分化晚期顯著上升[1,3]。

同源異型盒基因（Homeobox genes）家族成員多、分布廣，參與脊椎和無脊椎動物器官發(fā)育和組織形成[4]。同源異型盒基因主要分為兩類，一類是HOX基因，該基因家族成員在染色體上成簇排列；另一類是non-HOX基因，其家族成員分散在不同染色體上[5]。同源異型盒基因家族成員具有HD（Homeodomain）同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是同源異型盒基因結(jié)合DNA并發(fā)揮其功能的主要結(jié)構(gòu)域。HOPX基因（Homeodomain only protein X）屬于non-HOX基因家族[6]，又被稱為HOD、HOP、OB1、LAGY、TOTO、CAMEO、NECC1或SMAP31，是目前已知最小的同源結(jié)構(gòu)域蛋白[7]。HOPX基因編碼的蛋白一般含有73個氨基酸殘基，其中60個氨基酸殘基構(gòu)成一個非典型的HD同源結(jié)構(gòu)域[7]。研究發(fā)現(xiàn)HOPX基因同源結(jié)構(gòu)域中與DNA結(jié)合的必要氨基酸發(fā)生突變[8]，發(fā)現(xiàn)HOPX具有特殊蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)[9]，導(dǎo)致HOPX不能直接結(jié)合DNA雙鏈。HOPX通過與其他蛋白相互作用而發(fā)揮其生物學(xué)功能，目前已發(fā)現(xiàn)HOPX能夠與SRF（Serum re?sponse factor）[7-9]、Epc1（Enhancer of polycomb 1）[10]和HDAC2（Histone deacetylase 2）相互作用[11-12]。研究結(jié)果表明，HOPX基因是哺乳動物心臟正常發(fā)育的重要調(diào)控因子[7,13-14]，也是癌細胞增殖的負調(diào)控因子[15-16]。除此之外，HOPX基因也參與骨骼肌細胞分化[10]、免疫應(yīng)答反應(yīng)[17]和角質(zhì)細胞分化[6,18]等。目前，HOPX基因在脂肪生長發(fā)育中的研究尚未見報道。

農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室前期的表達譜芯片和Northern Blot分析發(fā)現(xiàn)，雞HOPX基因在雞脂肪組織中表達量較高[19]，且具有一定脂肪組織表達特異性[20]。此外，HOPX基因在高、低脂系肉雞腹部脂肪組織間差異表達[20]。因此，推測HOPX基因可能在雞脂肪生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。本研究開展過表達HOPX基因?qū)χ旧L發(fā)育重要基因KLF 7、PPARγ、C/EBPα、FAS和A-FABP表達影響分析，研究結(jié)果將有助于揭示HOPX基因在雞脂肪生長發(fā)育中作用，為闡明雞脂肪生長發(fā)育分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

12日齡商業(yè)化AA肉仔雞。

1.1.2 試驗試劑

TRIzol?Reagent和LipofectamineTM2000購自In?vitrogen（USA）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司（USA）；DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM、胎牛血清（FBS）和膠原酶I購自Gibco公司（USA）；油酸鈉購自Sigma公司（USA）；Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）購自Roche公司（Switzerland）；RNase free water購自TaKaRa公司（Japan）。

1.1.3 試驗載體

pCMV-HA vector購自Clontech公司（USA）；pCMV-HA-HOPX真核過表達載體，海腎熒光素酶報告基因載體，雞FAS啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic-FAS（-1086/+170）；雞PPARγ啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic-PPARγ （-1985/-89）；雞C/EBPα啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic-C/EBPα（-2214/-19）；雞KLF 7啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic-KLF 7 （-2270/-70）；雞A-FABP啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-basic-A-FABP（-1983/+35）均由農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 雞前脂肪細胞原代培養(yǎng)

采用農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室建立的肉仔雞腹部脂肪組織前脂肪細胞分離和培養(yǎng)方法[21]，體外分離和培養(yǎng)雞原代前脂肪細胞。具體操作如下：選取12日齡AA肉仔雞，在無菌條件下采集腹部脂肪組織，放入裝有無菌PBS的平皿中，反復(fù)沖洗，除去血管和筋膜，剪碎組織，轉(zhuǎn)入含有消化液的試管中，37℃消化65 min，每隔5 min輕輕搖動一次。消化完畢，加入全培養(yǎng)基（DMEM/F12+ 10%FBS+1%K）終止消化，輕輕吹打均勻，分別經(jīng)100和600目不銹鋼篩網(wǎng)過濾。過濾后培養(yǎng)基混合液分裝入15 mL離心管中，700 g離心10 min，棄培養(yǎng)液，用紅細胞裂解液重懸細胞，室溫孵育10 min后輕輕吹勻，將細胞懸液700 g離心10 min，細胞沉淀用全培養(yǎng)基重懸，700 g離心10 min，再用培養(yǎng)基重懸，重懸后的細胞懸液為基質(zhì)-血管細胞（S-V細胞），即前脂肪細胞。將分離的前脂肪細胞記數(shù)后，按（2～3）×105·mL-1密度接種，置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，48 h后換液，細胞匯合度達到80%～90%時進行傳代。

1.2.2 細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

按照TRIzol?Reagent說明書操作步驟提取總RNA，所得總RNA進行OD值測定，OD260/280在1.8～2.0即為RNA合格；反轉(zhuǎn)錄參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA在-20℃保存。

1.2.3 前脂肪細胞轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化

以12日齡AA肉仔雞腹部脂肪組織為原材料，體外分離、培養(yǎng)雞原代前脂肪細胞，待細胞密度達到傳代條件后（見1.2.1），將細胞傳代接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞密度達到80%～90%匯合度時進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系和操作步驟按照Lipo?fectamineTM2000說明書進行，轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)本實驗室前期研究確認的適宜雞原代前脂肪細胞分化的油酸濃度（160 μmol·L-1），對雞原代前脂肪細胞進行誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)0 h（轉(zhuǎn)染24 h）、誘導(dǎo)24 h（轉(zhuǎn)染48 h）、誘導(dǎo)48 h（轉(zhuǎn)染72 h）和誘導(dǎo)72 h（轉(zhuǎn)染96 h）后，利用Trizol法收集細胞。

1.2.4 Real-time RT-PCR檢測

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用Real-time PCR儀（ABI 7500）進行Real-time RT-PCR檢測。反應(yīng)體系為：Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）（2×）5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，總體積為10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃復(fù)性延伸60 s，共40個循環(huán)。以β-ac?tin基因為內(nèi)參，利用2-ΔCt方法將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對基因表達量。所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primers used in this study

1.2.5 啟動子熒光素酶報告基因活性檢測

以雞原代前脂肪細胞、雞胚成纖維細胞系（DF1）和雞永生化前脂肪細胞系（ICPA-I）為試驗材料，將細胞按照（2～3）×105·mL-1密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達80%～90%時，將0.2 μg報告基因質(zhì)粒和0.8 μg真核表達載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染雞原代前脂肪細胞、DF1和ICPA-I，其中報告基因質(zhì)粒和pCMV-HA-HOPX質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為試驗組，報告基因質(zhì)粒和pCMV-HA vector質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染為對照組，轉(zhuǎn)染細胞在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）試劑盒說明書進行操作，采用化學(xué)單管檢測儀，分別測定各組海腎（內(nèi)參）和螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用JMP 5.0軟件進行t檢驗分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達HOPX基因?qū)χ景l(fā)育相關(guān)重要基因表達的影響

為了解HOPX基因在雞脂肪組織生長發(fā)育中的作用，選取與雞脂肪發(fā)育相關(guān)的重要基因KLF 7、PPARγ、C/EBPα、FAS和 A-FABP，利用 Re?al-time RT-PCR方法，以β-actin為內(nèi)參，分析在雞原代前脂肪細胞分化過程中HOPX基因過表達對這5個基因表達的影響。結(jié)果顯示，與對照組（pC?MV-HA vector）相比，HOPX基因過表達可降低KLF 7基因表達量，且在雞前脂肪細胞誘導(dǎo)分化24 h時，達顯著差異（P＜0.05，見圖1-A），在誘導(dǎo)分化72 h時，達極顯著差異（P＜0.01，見圖1-A）；HOPX基因過表達可提高PPARγ、C/EBPα和A-FABP基因表達量，其中，PPARγ基因表達量在雞前脂肪細胞誘導(dǎo)分化48和72 h時達到顯著差異（P＜0.05，見圖1-B），C/EBPα基因表達量在誘導(dǎo)分化24 h時達顯著差異（P＜0.05，見圖1-C），A-FABP基因的表達量則在誘導(dǎo)分化0 h時達顯著差異（P＜0.05），誘導(dǎo)分化72 h時，呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01，見圖1-E）；過表達HOPX基因?qū)AS基因表達無影響（見圖1-D）。

圖1 HOPX過表達對前脂肪細胞KLF 7、PPARγ、C/EBPα、FAS和A-FABP基因表達的影響Fig.1 Effects of HOPX overexpression on mRNA expression levels of KLF 7,PPARγ, C/EBPα,FAS and A-FABP during chicken preadipocyte differentiation

2.2 過表達HOPX基因?qū)χ炯毎只嚓P(guān)重要基因啟動子活性的影響

為進一步了解HOPX基因?qū)χ景l(fā)育重要基因啟動子活性的影響，利用熒光素酶雙報告基因技術(shù)，分析HOPX基因過表達對KLF 7、PPARγ、C/ EBPα、FAS和A-FABP基因啟動子活性的影響。結(jié)果顯示，與對照組（pCMV-HA vector）相比，在雞原代前脂肪細胞中，過表達HOPX基因能極顯著抑制KLF 7基因的啟動子活性（P＜0.01，見圖2-A-1），顯著增強A-FABP基因啟動子活性（P＜0.05，見圖2-E-1），但對PPARγ、C/EBPα和FAS基因啟動子活性無影響（見圖2-B-1，圖2-C-1，圖2-D-1）；在雞胚成纖維細胞系（DF1）中，過表達HOPX基因可顯著抑制KLF 7基因啟動子活性（P＜0.05，見圖2-A-2），顯著增強PPARγ和AFABP基因啟動子活性（P＜0.05，見圖2-B-2，圖2-E-2），但是對C/EBPα和FAS基因啟動子活性無影響（見圖2-C-2，圖2-D-2）；在雞永生化前脂肪細胞系（ICPA-I）中，過表達HOPX基因能顯著抑制KLF 7基因啟動子活性（P＜0.05，見圖2-A-3），顯著增強PPARγ基因啟動子活性（P＜0.05，見圖2-B-3），對C/EBPα、FAS和A-FABP基因啟動子活性無影響（見圖2-C-3，圖2-D-3，圖2-E-3）。

圖2 HOPX過表達對雞KLF 7、PPARγ、C/EBPα、FAS和A-FABP基因啟動子活性的影響Fig.2 Effectsof HOPXoverexpressiononthepromoteractivitiesofchickenKLF7,PPARγ,C/EBPα,FASandA-FABPgenes

3 討論與結(jié)論

HOPX基因在哺乳動物心臟發(fā)育及癌癥發(fā)生中的研究已比較深入，但在其他器官和組織發(fā)育中的研究相對較少。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂系肉雞腹部脂肪組織的比較分析發(fā)現(xiàn)，隨著高、低脂系肉雞生長，高脂系肉雞腹部脂肪細胞數(shù)目及脂肪細胞體積均高于低脂系雞[22]，結(jié)合本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，HOPX基因在東農(nóng)高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中差異表達。因此，推測HOPX基因可能是導(dǎo)致東農(nóng)高、低脂系肉雞脂肪性狀差異重要基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)HOPX基因影響雞脂肪生長發(fā)育重要基因表達和啟動子活性，因此推測HOPX基因參與雞脂肪組織生長發(fā)育調(diào)控。

骨骼肌細胞和前體脂肪細胞均起源于間充質(zhì)干細胞[23]，Kee等研究證明，HOPX基因能夠促進骨骼肌細胞分化[10]，但HOPX基因是否促進雞前脂肪細胞分化尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，HOPX基因能夠顯著上調(diào)PPARγ、C/EBPα和A-FABP基因mRNA的表達（見圖1-B，圖1-C，圖1-E），在前脂肪細胞誘導(dǎo)分化24 h時，過表達HOPX基因會使C/ EBPα基因表達量顯著升高（見圖1-C），同時，會顯著下調(diào)脂肪分化負調(diào)控因子KLF 7的表達量（見圖1-A），推測HOPX基因可能具有促進雞前脂肪細胞分化作用。雞原代前脂肪細胞、雞胚成纖維細胞系（DF1）及雞永生化前脂肪細胞系（ICPA-I）中熒光素酶雙報告基因分析結(jié)果表明，HOPX基因能夠增強A-FABP和PPARγ基因的啟動子活性（見圖2-E-1/2、圖2-B-2/3），抑制KLF 7基因啟動子活性（見圖2-A-1/2/3）。熒光素酶雙報告基因分析結(jié)果與mRNA表達檢測分析結(jié)果基本一致，提示HOPX基因可能具有促進雞前脂肪細胞分化作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同細胞中HOPX基因過表達對不同脂肪發(fā)育重要基因啟動子活性影響存在差異，這可能由于這些細胞遺傳背景和細胞狀態(tài)不同。表達分析發(fā)現(xiàn)，過表達HOPX基因48 h（誘導(dǎo)24 h）時，C/EBPα基因表達量升高（見圖1-C），但pCMVHA-HOPX和pGL3-basic-C/EBPα（-2214/-19）共轉(zhuǎn)染48 h后，報告基因檢查發(fā)現(xiàn)，HOPX基因過表達對C/EBPα基因啟動子活性無顯著影響（P＞0.05，見圖2-C）。導(dǎo)致這一差異原因可能是由于C/EBPα基因啟動子報告基因載體為質(zhì)粒，可能不能反映染色體上C/EBPα基因啟動子的真實狀態(tài)和活性，但這一推測需進一步試驗驗證。

HOPX基因作為轉(zhuǎn)錄輔助因子不能與DNA結(jié)合，只能通過與其他蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，目前已知與HOPX基因相互作用的3個蛋白中，HDAC2和SRF均與脂肪細胞分化有關(guān)。Mikkelsen等研究表明，SRF能抑制小鼠3T3-L1細胞分化[24]；Yoo等研究表明，抑制HDAC2能促進脂肪細胞分化[25]。因此推測在雞脂肪細胞發(fā)育過程中，HOPX可能通過與SRF和/或HDAC2蛋白互作調(diào)控雞脂肪細胞分化。

本研究揭示過表達HOPX基因?qū)χ景l(fā)育（分化）重要基因表達和啟動子活性影響。由于脂肪細胞分化過程復(fù)雜，要闡明HOPX基因在雞前脂肪細胞分化中的作用，除基因表達檢測和啟動子活性分析外，還需要開展細胞形態(tài)學(xué)、脂肪合成以及HOPX分子作用機制等研究。雖然HOPX基因在雞脂肪細胞分化中的功能及分子作用機制有待深入研究，但是可確定HOPX是新的脂肪生長發(fā)育調(diào)控因子。

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Effect ofHOPXoverexpression on expression of the important devel?opmental genes in chicken adipose

WANG Ning,SHI Hongyan,CHENG Min,SUN

Yingning,LI Hui(Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture,School of Animal Science and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

To explore the functions ofHOPXin chicken adipose development,in the present study, the effects ofHOPXoverexpression on mRNA expression and promoter activity of the important developmental genes in chicken adipose tissue were tested using Real-time RT-PCR and luciferase reporter assays.The results showed that compared to empty vector control,HOPXoverexpression increased the mRNA expression and promoter activities ofA-FABPandPPARγgenes,decreased the mRNA expression and promoter activity ofKLF7 gene,butHOPXoverexpression had no effect on mRNA expression and promoter activity ofFASgene.The results of this study indicate thatHOPXmay promote chicken preadipocyte differentiation.

HOPX;chicken;adipopocyte differentiation;development

S831

A

1005-9369（2015）05-0044-07

2014-04-02

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2009CB941604）；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-42）；黑龍江高?？萍紕?chuàng)新團隊建設(shè)項目（2010td02）

王寧（1964-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物遺傳育種。E-mail:wayane123@aliyun.com