王鵬飛，王穎芳，段廣才，3，王琳琳，郭向嬌，薛澤潤(rùn)，郗園林，楊海燕

（1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，河南 鄭州 450001；2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生教研室，河南 洛陽(yáng) 471003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是近年發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)外源核酸片段具有獲得性免疫能力的結(jié)構(gòu)，主要由一段不連續(xù)的正向重復(fù)序列和插入其中的間隔序列組成［1］。重復(fù)序列相對(duì)保守，具有回文結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)細(xì)菌在進(jìn)化中的保守性，間隔序列高度可變，研究［2］顯示間隔序列來(lái)源于外源可移動(dòng)遺傳因子。重復(fù)序列與間隔序列構(gòu)成的單元經(jīng)常被整體刪除，使得CRISPR系統(tǒng)迅速進(jìn)化，一定程度上也反映了細(xì)菌在進(jìn)化中的保守性和包容性［3］。志賀菌引起的細(xì)菌性痢疾（簡(jiǎn)稱菌?。┦且粋€(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，尤其對(duì)發(fā)展中國(guó)家造成了重大危害，其引起的感染性腹瀉給我國(guó)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)［4－5］。隨著抗生素廣泛應(yīng)用，志賀菌耐藥形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)重，且多耐藥菌株也越來(lái)越多，而外源性耐藥基因的獲得，即耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，是細(xì)菌增強(qiáng)耐藥性的主要方式之一［5－7］。CRISPR及其相關(guān)蛋白Cas組成的CRISPR／Cas系統(tǒng)，能夠形成特異免疫機(jī)制來(lái)處理外來(lái)遺傳物質(zhì)入侵，可能與致病菌耐藥性的變遷有密切關(guān)系。每個(gè)CRISPR元件的重復(fù)序列對(duì)應(yīng)著一種潛在的CRISPR／Cas靶標(biāo)，CRISPR／Cas系統(tǒng)獲得新的間隔序列后，能夠在未來(lái)識(shí)別相應(yīng)的病原體而發(fā)揮作用，故間隔序列是CRISPR／Cas系統(tǒng)最終發(fā)揮功能作用的核心序列元件［8］。目前，國(guó)際上對(duì)細(xì)菌CRISPR研究逐漸增多，本研究針對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的志賀菌株CRISPR序列進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室和數(shù)據(jù)庫(kù)中志賀菌的重復(fù)序列及間隔序列進(jìn)行同源性分析，了解CRISPR的結(jié)構(gòu)特征，探討間隔序列的可能來(lái)源及其與同源質(zhì)?；蚴删w的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示CRISPR的結(jié)構(gòu)特征及其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑、儀器和軟件

志賀菌種（mel－ss2004103／sx、 melsf2007065／hn、S51203）均為河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買、收集和保存，9株全基因組志賀菌，菌株基本信息均來(lái)自于NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）。見表1。

表1 志賀菌基本信息Tab.1 General informations of Shigella

細(xì)菌基因組提取試劑盒（購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司），酵母浸粉和胰蛋白胨（購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司），瓊脂粉（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），水解酪蛋白（Mueller－Hinten，MH）和瓊脂（購(gòu)自上海化學(xué)試劑有限公司），pH精密試紙（購(gòu)自天津市金達(dá)化學(xué)試劑廠），其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，液體培養(yǎng)基在本實(shí)驗(yàn)室按配方配制。LabcyCler basic梯度PCR儀（購(gòu)自德國(guó)SensoQuest公司），DYY－Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀和DYC31B型水平電泳槽（購(gòu)自北京六一儀器廠），Gene Genius Bio imaging System（購(gòu)自美國(guó)Syngene公司），THZ－92C臺(tái)式恒溫振蕩器（購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），BP221S電子天平（購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司），HVE－50型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（購(gòu)自日本Hirayama公司）。本研究采用的本地軟件及網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器包括：Primer premier 5、DNAMAN、ClustalX、Bioedit、CRISPR database （http：／／crispr.upsud.fr／crispr／）、RNAfoldwebserver（http：／／rna.tbi.univie.ac.at／cgi－bin／RNAfold.cgi ） 及 weblogo（http：／／weblogo.berkeley.edu／logo.cgi）。

1.2 志賀菌CRISPR序列引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Database公布的志賀菌的CRISPR信息，依據(jù)側(cè)翼序列進(jìn)行分組比較，選取其中的3組進(jìn)行CRISPR序列的引物設(shè)計(jì)，分別為：P1（正向：5′－ACCGCTGGCATCGTTGTTG－3′，反 向：5′－ATGAGCGTGGACGAAGTGC－3′）、P2（正 向：5′－AAGCACAAGGCGGAAGCAG－3′，反 向：5′－ATCCTGACGGGCGACAAAG－3′）和P7（正向：5′－CGCTGTATTATCAGAACACCCG－3′，反 向：5′－GGGCTACGACCCTGAATGGAAT－3′），引 物設(shè)計(jì)采用Primer premier 5軟件。

1.3 PCR反應(yīng)

采用梯度PCR方法確定3對(duì)引物的退火溫度，采用小劑量擴(kuò)增體系，以mel－sf2007065／hn菌株基因組DNA為模板，根據(jù)電泳結(jié)果確定最佳退火溫度T，利用該3對(duì)引物分別對(duì)菌株基因組進(jìn)行CRISPR序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物梯度擴(kuò)增體系（12.5μL）：10× PCR 反 應(yīng) 緩 沖 液 1.25 μL，dNTPs 2μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq 酶 0.18 μL，ddH2O 7.07 μL。CRISPR序列擴(kuò)增體系（50μL）：10×buffer（含Mg2＋）5μL，dNTPs 8μL，上下游引物各2μL，模 板 DNA 4 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 28.5μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 5min；94℃變性60s，退火60s，72℃ 延伸1min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.4 CRISPR檢測(cè)及同源性分析

委托上海生物工程股份有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列進(jìn)行純化、測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果后，構(gòu)建出該菌株的CRISPR序列結(jié)構(gòu)以及重復(fù)序列和間隔序列信息。依據(jù)P1、P2和P73對(duì)引物序列，識(shí)別全基因組志賀菌CRISPR序列，獲得相應(yīng)的重復(fù)序列及間隔序列，進(jìn)行多序列比對(duì)，分析重復(fù)序列的堿基頻率并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。分析間隔序列的特點(diǎn)，并用BLAST對(duì)間隔序列的同源質(zhì)粒／噬菌體進(jìn)行檢索，并對(duì)其進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 志賀菌CRISPR的識(shí)別

分別用P1、P2和P73對(duì)引物對(duì) melsf2007065／hn菌株基因組進(jìn)行梯度擴(kuò)增，退火溫度 梯 度 為 54.6℃、55.5℃、56.7℃、57.9℃、59.3℃、60.7℃、62.1℃、63.3℃、64.5℃和65.4℃。3對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的效率隨著溫度有遞增或遞減，其退火溫度范圍為54.6℃～55.5℃、60.7℃～63.3℃和60.7℃～63.3℃，故確定其最佳退火溫度分別為55℃、62℃和62℃。根據(jù)最佳退火溫度，分別用P1、P2和P7對(duì)3株志賀菌的CRISPR序列進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)CRISPRs Finder及多序列比對(duì)進(jìn)行CRISPR序列查找。菌株的CRISPR詳細(xì)信息見表2。

根據(jù)引物序列及實(shí)驗(yàn)室菌株CRISPR信息，獲得12株全基因組志賀菌相應(yīng)的重復(fù)序列及間隔序列模式圖（圖1）。在鮑氏和痢疾志賀菌中，P7－CRISPR序列中僅保存一個(gè)重復(fù)序列片段，P2－CRISPR中僅存在1個(gè)間隔序列。P1－CRISPR與P2－CRISPR廣泛分布在志賀菌的4個(gè)群，其間隔序列的數(shù)目有差異。

2.2 間隔序列的特性及同源性

2.2.1 不同CRISPR間隔序列的特點(diǎn) 在88、ss046和ss53g的菌株中，P1－CRISPR序列幾乎一致，均存在4個(gè)間隔序列，且間隔序列具有很高的同源性；在其他菌株中，P1類型的間隔序列僅有1個(gè)。僅在P1－CRISPR－88間隔序列的首尾存在個(gè)別堿基的差別，而在P2－CRISPR中卻不存在該情況，2個(gè)間隔序列完全不同，此特點(diǎn)體現(xiàn)出間隔序列的多樣性，含P7－CRISPR的菌株，其間隔序列均相同。見圖2。

表2 志賀菌CRISPR信息Tab.2 CRISPR informations of Shigella

圖1 12株志賀菌CRISPR模式圖Fig.1 CRISPR pattern diagram of 12strains of Shigella

2.2.2 間隔序列與側(cè)翼序列的聯(lián)系 在P1－CRISPR中，第一個(gè)重復(fù)序列上游側(cè)翼序列20bp與spacer 4的末端序列一致，末端重復(fù)序列下游23bp與spacer 4的前端序列一致。在其他菌株的P1－CRISPR中，也存在相同的現(xiàn)象，說(shuō)明此現(xiàn)象的普遍性，可能發(fā)揮著獨(dú)特的功能。在P7－CRISPR同樣存在相似的現(xiàn)象，第一個(gè)重復(fù)序列上游側(cè)翼序列25bp與間隔序列的末端序列一致，但在下游，僅12bp的序列在上游側(cè)翼序列中存在，而在P2－CRISPR中不存在該現(xiàn)象。

圖2 P1－CRISPR－88（A）和P7－CRISPR－88（B）間隔序列與側(cè)翼序列的多序列比對(duì)圖Fig.2 Comparison chart of multiple alignment between spacers and flanking sequences P1－CRISPR－88（A）and P7－CRISPR－88（B）

2.2.3 間隔序列的同源性 將間隔序列進(jìn)行BLAST（數(shù)據(jù)庫(kù)包括1683個(gè)質(zhì)粒和1429個(gè)噬菌體，E＜1.0），在同源質(zhì)粒／噬菌體中獲得該序列對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)。在間隔序列中并未發(fā)現(xiàn)完全匹配的序列，但個(gè)別間隔序列對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)的產(chǎn)物很豐富，猜測(cè)某些間隔序列可能是2個(gè)或多個(gè)外源序列的拼接融合。有的間隔序列并沒(méi)有對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)，有的間隔序列則并未發(fā)現(xiàn)同源質(zhì)粒／噬菌體。見表3。

P7－spacer對(duì)應(yīng)的編碼產(chǎn)物有復(fù)制蛋白、TniQ蛋白和絡(luò)氨酸重組酶等，有的序列處于非編碼區(qū)，因此推測(cè)此間隔序列是多個(gè)基因特殊序列的拼接重組，通過(guò)分析，這些基因與信息基因和操縱基因有關(guān)。兩類基因形成P7spacer后，當(dāng)外源遺傳元素再次作用于P7spacer時(shí)，首先通過(guò)復(fù)制蛋白基因（信息基因）進(jìn)行識(shí)別，然后結(jié)合其他基因或是非編碼的調(diào)控，來(lái)指導(dǎo)功能基因（操縱基因）發(fā)揮作用。見圖3。

表3 間隔序列的同源質(zhì)粒／噬菌體Tab.3 Homologous plasmids or phages of spacers

圖3 間隔序列可能的形成及功能機(jī)制圖Fig.3 Diagram of possible forming and functional mechanism of spacers

2.3 重復(fù)序列的特點(diǎn)及同源性

2.3.1 重復(fù)序列的多序列比對(duì) 在宋內(nèi)志賀菌菌株中，P1－CRISPR存在5個(gè)重復(fù)序列，其余均是2個(gè)重復(fù)序列。將P1－CRISPR的重復(fù)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得相應(yīng)的堿基頻率圖（圖4A），P1－CRISPR的重復(fù)序列差異主要集中在第20、21和34位。P2－CRISPR的重復(fù)序列形成2種堿基頻率圖，P2－DR－1（圖4B）和P2－DR－2（圖4C），其中P2－DR－2是 CRISPR最末端的重復(fù)序列。P2－DR－1的差異僅在第25位堿基，P2－DR－2的差異在第17和18位，兩者僅是3′端的堿基具有較大差異，5′端具有很好的一致性。P7－CRISPR的重復(fù)序列則比較保守，并不存在堿基的差異（圖4D）。

2.3.2 重復(fù)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 依據(jù)重復(fù)序列的堿基頻率，對(duì)重復(fù)序列做出相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5），并記錄形成結(jié)構(gòu)的最小自由能。P1－CRISPR重復(fù)序列形成 “多莖”結(jié)構(gòu)，其最小自由能為－14.90kcal·mol－1，第20和21位于環(huán)上，第34若由T變?yōu)镚，即GC相連，則該二級(jí)結(jié)構(gòu)變的更為穩(wěn)定。P2－CRISPR重復(fù)序列形成的均為 “單莖”結(jié)構(gòu)，P2－DR－1的最小自由能為－9.00kcal·mol－1，其差異位于游離部分，P2－DR－2的最小自由能為－1.10kcal·mol－1，其差異同樣位于游離部分，但兩者莖區(qū)長(zhǎng)不同，前者為5堿基，后者為3堿基，故兩者最小自由能有較大的差異。P7－CRISPR重復(fù)序列形成的也為 “多莖”結(jié)構(gòu)，其最小自由能為－20.70kcal·mol－1，其重復(fù)序列比較保守，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

圖4 重復(fù)序列的堿基頻率圖Fig.4 Frequency diagram of bases of repeats

2.3.3 重復(fù)序列的同源性 對(duì)不同CRISPR重復(fù)序列進(jìn)行同源聚類分析，對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行探索（圖6），P7－CRISPR的重復(fù)序列不存在堿基差異。P1－CRISPR不同位置的重復(fù)序列存在差異，鮑氏及痢疾志賀菌的重復(fù)序列與宋內(nèi)或福氏志賀菌的末端重復(fù)序列一致，宋內(nèi)志賀菌的DR2－DR4序列幾乎一致，DR1同樣如此；P2－CRISPR的末端重復(fù)序列與CRISPR的5′端重復(fù)序列存在較大差異，10號(hào)與88號(hào)菌株的末端重復(fù)序列一致，而CRISPR的5′端重復(fù)序列卻存在差異。CRISPR的5′端重復(fù)序列臨近的間隔序列是菌株新近得到的外源序列，CRISPR5′端重復(fù)序列會(huì)隨著間隔序列的改變而進(jìn)化，從而影響CRISPR功能。依據(jù)P1－CRISPR 5′端重復(fù)序列（即DR1）聚類分析，可將10個(gè)菌株分為3類，同樣P2－CRISPR則為2類（共11個(gè)菌株），某些特殊的重復(fù)序列可能是該菌株新功能的體現(xiàn)。

圖5 重復(fù)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)示意圖Fig.5 Schematic diagram of secondary structures of repeats

分別對(duì)3個(gè)重復(fù)序列進(jìn)行BLAST（最大顯示數(shù)默認(rèn)為100，E＜0.1），此3個(gè)重復(fù)序列存在于大腸桿菌，這與其菌屬親緣關(guān)系具有一定的一致性。但在不同菌屬間也存在相應(yīng)的重復(fù)序列，如P1中的Salmonella，P2中的Pectobacterium和P7中的Uncultured bacterium，說(shuō)明志賀菌的CRISPR系統(tǒng)中存在同源不同種的現(xiàn)象。見圖7（插頁(yè)三）。

3 討 論

本研究結(jié)果表明：本室保存的志賀菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中志賀菌的重復(fù)序列相同或是相似，將CRISPR序列與其進(jìn)行多序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其同源性較高，此為同一種CRISPR結(jié)構(gòu)；同時(shí)，部分序列存在差異，可能是因?yàn)榧?xì)菌為了適應(yīng)不同的生存環(huán)境，而產(chǎn)生的分化或是進(jìn)化［1，9］。

由重復(fù)序列的多序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)可知，不同CRISPR的重復(fù)序列保守性并不相同，重復(fù)序列位點(diǎn)的差異或在莖，或在環(huán)，或在游離部分。莖上的差異會(huì)影響RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，P2－DR－1與P2－DR－2的莖區(qū)長(zhǎng)相差2堿基，其最小自由能變化很大，后者二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低；環(huán)上的差異同樣會(huì)影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，P1－CRISPR重復(fù)序列中環(huán)內(nèi)堿基不同，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性存在差異；游離部分的差異有可能影響RNA與蛋白質(zhì)等結(jié)合位點(diǎn)的變化。研究［10］顯示：重復(fù)序列的3′端是包含PAM motif的最后幾個(gè)堿基，而PAMs最后的堿基不保守，因此重復(fù)序列的3′端游離部分才會(huì)有位點(diǎn)的變化。

重復(fù)序列的莖區(qū)GC水平相對(duì)較高，G∶C堿基對(duì)之間是以3個(gè)氫鍵相連，分子相互作用力更強(qiáng)，能夠釋放更多的自由能，更為穩(wěn)定；同時(shí)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄后RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性，也突出重復(fù)序列在 CRISPR結(jié)構(gòu)及功能上的重要性［9，11］。P2－DR－2是 CRISPR 的末端重復(fù)序列，其3′端與P2－DR－1的3′端有較大變化，同時(shí)其穩(wěn)定性也較差，而P1－CRISPR重復(fù)序列和P3－CRISPR重復(fù)序列的莖區(qū)則未見此差異。由重復(fù)序列的同源聚類分析可知，隨著菌株的進(jìn)化，CRISPR也會(huì)隨之進(jìn)化，其5′端重復(fù)序列會(huì)有個(gè)別位點(diǎn)的突變來(lái)維持自身的生存，更好地適應(yīng)外界環(huán)境。CRISPR 5′端重復(fù)序列進(jìn)行的志賀菌聚類分析，為利用CRISPR來(lái)發(fā)現(xiàn)某些特殊類型的志賀菌提供了可能。

圖6 P1－CRISPR（A）和P2－CRISPR（B）重復(fù)序列的同源樹Fig.6 Homology tree of repeats of P1－CRISPR（A）and P2－CRISPR（B）

間隔序列可能來(lái)源于質(zhì)?；蚴删w，被作為外源遺傳物質(zhì)入侵細(xì)菌留下的特異性標(biāo)記，在此次研究中，并沒(méi)有顯示出100%匹配，且部分間隔序列并沒(méi)有同源噬菌體或質(zhì)粒，其原因可能是由于質(zhì)粒或噬菌體的進(jìn)化導(dǎo)致該基因的缺失或是目前尚未獲得此類質(zhì)?；蚴删w［10］。盡管如此，間隔序列的部分序列與質(zhì)?；蚴删w存在同源性，且某些間隔序列可包含同源質(zhì)?；蚴删w的多個(gè)序列編碼產(chǎn)物，提示某些間隔序列可能是多個(gè)間隔序列或同源質(zhì)粒或噬菌體中特殊序列的整合。rep基因與質(zhì)粒復(fù)制子（ori）間有密切聯(lián)系，rep基因編碼的Rep蛋白可結(jié)合ori內(nèi)部多個(gè)位點(diǎn)發(fā)揮作用；P7spacer的部分序列與質(zhì)粒的rep基因序列一致，因此某些間隔序列發(fā)揮作用時(shí)，質(zhì)粒ori可能參與其中。據(jù)此推測(cè)，間隔序列在形成時(shí)，至少有2類基因的重組融合，一類是起到識(shí)別和調(diào)控的信息基因，另一類是起功能作用的操縱基因。在某些CRISPR中，間隔序列的部分序列與側(cè)翼序列存在同源性，說(shuō)明CRISPR中普遍存在基因重組現(xiàn)象，其有利于CRISPR維持自身的生存及進(jìn)化，保持自身基因組的穩(wěn)定性。在同一個(gè)CRISPR中，多個(gè)間隔序列具有很高的相似性，該現(xiàn)象在CRISPR中并不常見，其具體作用尚未明確，有可能作為一種增強(qiáng)機(jī)制來(lái)維護(hù)CRISPR功能。

不同CRISPR在不同種群中的分布不同，在不同親緣關(guān)系中的重復(fù)序列具有較高的同源性，說(shuō)明CRISPR同源性與菌株親緣性之間的關(guān)系并不密切，可能與CRISPR序列的水平基因轉(zhuǎn)移有關(guān)，而這一現(xiàn)象已在多種菌種中發(fā)現(xiàn)［9，12－14］。研究［15］顯示：水平基因轉(zhuǎn)移是細(xì)菌抗生素抗藥的主要原因，并且在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。多項(xiàng)研究［12，16－17］已經(jīng)證實(shí)：在乳酸菌和金黃色葡萄球菌中，CRISPR與耐藥性之間有關(guān)聯(lián)。因此，通過(guò)CRISPR限制志賀菌中耐藥性基因在細(xì)菌間的傳播成為可能，從而為志賀菌耐藥問(wèn)題提供研究思路。

本研究采用PCR法擴(kuò)增出志賀菌中存在的CRISPR，雖然所用菌株數(shù)量少，但也說(shuō)明PCR方法在檢測(cè)志賀菌CRISPR中的實(shí)用性。同時(shí)分析了志賀菌CRISPR的重復(fù)序列，間隔序列的特點(diǎn)及同源性，說(shuō)明CRISPR系統(tǒng)的多樣性及復(fù)雜性，以及未來(lái)應(yīng)用的可行性。目前廣泛應(yīng)用的CRISPR／CAS9基因編輯技術(shù)僅是CRISPR應(yīng)用的一個(gè)方面，如何利用CRISPR的特點(diǎn)來(lái)探索、控制或改善志賀菌耐藥需要更多的研究。

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