張晶 ，劉玉杰,2，萬德有，劉蘊慧，王芳，武逸熏，付潔，宋海峰

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000

人表皮生長因子受體3（human epidermal growth factor receptor 3，HER3）是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的一員，該家族是目前最重要的癌癥治療靶點之一，被廣泛研究并應(yīng)用于多種癌癥的研究及治療中，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肺癌等。早在2005 年就有了第一個完全人源化的針對該家族中EGFR 的抗體藥物，而以HER2 為靶點的抗體藥物赫賽汀更是2014年公認的明星藥物之一。盡管C 端缺少激酶活性，但HER3 通過與HER2 和EGFR 形成異源二聚體，促發(fā)下游通路激活，在靶向HER2及EGFR的抗體類藥物如赫賽汀、西妥昔單抗等抗體類藥物的耐藥中HER3 補償性表達上調(diào)。因此，HER3 在機體耐藥機制中發(fā)揮重要作用[1-3]。自2010 年AVEO Pharma 完成首個HER3 抗體項目起[4]，已有多家公司和研究機構(gòu)針對HER3 靶點進行抗體研發(fā)工作[5]，且數(shù)量呈逐年增多狀態(tài)。

抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody conjudge drug，ADC）是目前抗體應(yīng)用的趨勢之一，如Seattle Genetics 公司以CD30 為靶點的Adcetris、羅氏公司以HER2 為靶點的Kadcyla。目前ADC 藥物雖然以全長型抗體為主，但藥物分子越大越難以透過毛細管內(nèi)皮層及穿過腫瘤細胞外間隙到達實體瘤的深部。基于上述不足，小型化或適度小型化是研制ADC 藥物的重要途徑，如scFv、Fab 類基因工程抗體受到越來越多的關(guān)注及應(yīng)用[6-8]。這類抗體因含有完整的抗體可變區(qū)而保留了與抗原特異性結(jié)合的能力，同時由于其分子小而更易于與其他藥物制備成不同形式的更為安全的疫苗和藥物制劑，同時也更易于通過較為經(jīng)濟的方式獲得抗體制備成診斷試劑[9]。

本實驗室前期構(gòu)建了哺乳動物細胞展示型全人源scFv 抗體庫，并通過流式細胞分選技術(shù)獲得了靶向人HER3 胞外區(qū)蛋白的scFv 抗體[10]。在本實驗中，我們?yōu)閷ER3 scFv 抗體改構(gòu)成Fab 形式，利用真核表達載體p3457 構(gòu)建了HER3 Fab 抗體真核表達質(zhì)粒，并通過293E 懸浮細胞進行表達，對其親和力及初步的生物學(xué)活性進行鑒定，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、293E 細胞由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α購自北京原平皓生物技術(shù)公司；pPICZα AVH-CH-VL-CL、pDisplay-scFv、p3457 均由本實驗室構(gòu)建并保存。

293E 細胞培養(yǎng)基購自Gbico 公司；BspQⅠ購自NEB 公司；PrimeSTAR 購自TaKaRa 公司；DNA maker 購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒購自康為世紀生物技術(shù)有限公司；PEI轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司；HRP 標記的抗His 抗體購自西美杰生物技術(shù)公司；兔抗人ERBB3（Nterm）單克隆抗體購自ABGENT 公司；羅丹明標記的抗兔IgG（H+L）多克隆抗體購自KPL 公司；DAPI 購自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK8檢測試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 HER3 Fab型抗體表達載體構(gòu)建

1.2.1 VH、VL、CH1、CL基因擴增 抗人源HER3抗體模板來源于本實驗室前期從真核哺乳動物細胞展示型人源scFv 抗體庫篩選的pDisplay-scFv 質(zhì)粒[11]。為從pDisplay-scFv 中擴增VH 及VL，設(shè)計引物PHfw/PHrv、PLfw/PLrv（表1），并在引物的5'端引入限制性酶切位點BSpQⅠ；為構(gòu)建Fab 型重鏈和輕鏈，設(shè)計引物PHfw'/PHrv'、PLfw'/PLrv'（表1），分別從本實驗室前期構(gòu)建的VEGF 全長抗體質(zhì)粒pPICZα A-VH-CH-VL-CL[11]中擴增CH1及CL基因。

VH、VL 的PCR 反應(yīng)體系：pDisplay-scFv 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv 或PLfw/PLrv（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O至50 μL。

CH1、CL 的PCR 反應(yīng)體系：pPICZα A-VH-CHVL-CL 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv 或PLfw/PLrv（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：98℃ 8 min；98℃ 30 s，55℃30 s，72℃40 s，28個循環(huán)；72℃10 min。

1.2.2 HC、LC 基因擴增 分別用DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒回收目的大小正確的VH、VL、CH1、CL，詳細步驟參見膠回收試劑盒說明書。分別通過重疊PCR 獲 得HC 及LC。重鏈PCR 反應(yīng)體系：CH1 1 μL，VH 1 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液10 μL，dDTP混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PHfw/PHrv'（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O 至50 μL。輕鏈PCR 反應(yīng)體系：CL 1 μL，VL 1 μL,5×Prime-STAR 緩沖液10 μL，dDTP 混合液4 μL，Primestar DNA 聚合酶0.5 μL，PLfw/PLrv'（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O至50 μL。

1.2.3 p3457-HC 及p3457-LC 質(zhì)粒構(gòu)建 分別用BspQⅠ酶切重鏈、輕鏈及載體p3457。酶切體系：HC/LC/p3457 2 μg，BspQⅠ1 μL，緩沖液1 μL，加ddH2O 至50 μL。50℃孵育2 h，65℃滅活20 min。酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)T4DNA 連接酶于16℃連接過夜。連接體系：HC、LC 各7 μL，p3457 1 μL，T4DNA 連接酶1 μL，T4緩沖液1 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，對挑取的單克隆進行質(zhì)粒小量提取和菌液PCR 鑒定，挑選陽性單克隆進行測序分析和表達鑒定。

1.3 p3457及p3457質(zhì)粒表達鑒定

用含10%新生牛血清和雙抗（工作濃度為100U/mL 的青霉素及工作濃度為0.1 mg/mL 的鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T 細胞，接種50 000細胞（貼壁時密度約30%）于24 孔板中，培養(yǎng)24 h，至細胞密度達70%時，按PEI轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染p3457-HC 及p3457-LC，轉(zhuǎn)染48 h 后收細胞上清，經(jīng)12.5% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再用1∶5000稀釋的HRP標記的小鼠抗His單克隆抗體室溫孵育1 h，經(jīng)TBST 漂洗3 次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

表1 PCR引物序列

1.4 HER3 Fab抗體表達條件摸索及純化

以0.8×106/mL 的密度接種處于對數(shù)生長期的293E細胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)至細胞濃度為（1.4×106～2.0×106）/mL 時，按PEI 轉(zhuǎn)染試 劑說明書將p3457-HC 及p3457-LC 分別按1∶1 的比例瞬時轉(zhuǎn)染，第3 d 向細胞中添加10×CB5（儲存濃度為33 g/L），并開始每天收集1 mL 細胞上清，第5 d 完全收集細胞，800 r/min 離心10 min 后收上清并用Western印跡檢測細胞上清中HER3 Fab的表達水平。

按優(yōu)化后的條件大量培養(yǎng)細胞以表達HER3 Fab 抗體，第5 d 收集細胞上清后用0.45 μm 濾膜過濾，用鎳親和柱純化細胞上清。平衡液配方：NaCl 500 mmol/L，磷酸鈉緩沖液20 mmol/L，pH7.4；洗脫液配方：NaCl 500 mmol/L，磷酸鈉緩沖液20 mmol/L，咪唑500 mmol/L，pH7.4。1～10 個柱體積內(nèi)咪唑濃度線性上升到100%洗脫，收集洗脫液，用PBS 置換緩沖液，將蛋白溶液分裝保存于-80℃。

1.5 ELISA檢測HER3 Fab與HER3的結(jié)合

用HER3 胞 外區(qū)（extracelluar membrane domain，ECD）蛋白（6 nmol/L）包被酶標板，4℃包被過夜；用1% BSA 于37℃封閉2 h；加入不同稀釋率的HER3 Fab 抗體，37℃孵育1 h；PBST 洗滌6 次，加入HRP 標記的抗His 抗體（1∶10000），37℃孵育1 h；PBST 洗滌6 次，加入TMB 底物顯色。以商品化的抗ERBB3（N-term）抗體為陽性對照，以PBS 替代HER3 Fab抗體為陰性對照。

1.6 ForteBio法鑒定HER3 Fab的親和力

采用ForteBio 法測定HER3 Fab 抗體與HER3的平衡解離常數(shù)KD。將HER3胞外區(qū)蛋白生物素化后，以20 μg/mL 的濃度固定在鏈霉親和素探針上，用PBS 平衡探針后，再與梯度稀釋的HER3 Fab 抗體（500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L）結(jié)合，以PBS 作為空白對照，然后探針再孵育在PBS 中進行解離。

1.7 CCK8 法檢測HER3 Fab 抗體對MDA-MB-453細胞增殖的影響

將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-453 細胞消化成單個細胞，以4000/孔接種到96 孔板中，24 h 后去除上清，第1、2組分別加入50 μL 完全培養(yǎng)基，第3、4組分別加入50 μL含40 μg/mL HER3 Fab抗體的完全培養(yǎng)基；1 h后第1、3組分別加入50 μL 完全培養(yǎng)基，第2、4組分別加入50 μL含200 ng/mL神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（NRG1）的完全培養(yǎng)基；每組設(shè)3 個復(fù)孔，24 h時分別加入10 μL CCK8，37℃孵育1 h后用酶標儀測定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒p3457-HC、p3457-LC及其表達產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1。VH、VL、CH1、CL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別可見359、309、315、315 bp 條帶（圖2A）；VH 及CH1 重疊PCR 產(chǎn)物HC、VL 與CL 重疊PCR 產(chǎn)物L(fēng)C 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別可見674、624 bp 條帶（圖2B）；質(zhì)粒p3457-HC 及p3457-LC 的大小分別為5184 及5134 bp。挑選單克隆經(jīng)菌液PCR 鑒定后分析均為陽性（圖2C）。挑選菌液PCR 陽性的單克隆進行小量質(zhì)粒提取并測序，編碼區(qū)序列完全正確（數(shù)據(jù)略），說明克隆構(gòu)建成功。Western 印跡結(jié)果顯示，p3457-HC及p3457-LC 質(zhì)粒分別瞬時共轉(zhuǎn)染293E 細胞的表達產(chǎn)物在相對分子質(zhì)量約25×103處可見目的條帶（結(jié)果略）。在瞬時共轉(zhuǎn)染293E 時，第5 d 時抗體表達量最高（圖3）。

2.2 抗體結(jié)合實驗及親和力檢測結(jié)果

ELISA 檢測表明HER3 Fab 能與HER3 胞外區(qū)蛋白直接結(jié)合（圖4）。采用ForteBio 實驗測定單克隆抗體與HER3 的平衡解離常數(shù)KD為1.08×10-8mol/L。

2.3 HER3 Fab 對MDA-MB-453 細胞增殖能力的影響

圖1 p3457-HC、p3457-LC表達載體的構(gòu)建

圖2 HER3 Fab質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

在NRG1 刺激的條件下將HER3 Fab 抗體與MDA-MB-453 細胞共同孵育24 h，CCK8 法檢測結(jié)果表明NRG1 刺激組（第2 組）與未刺激組（第1 組）結(jié)果有顯著差異（P=0.03），說明細胞經(jīng)100 ng/mL NRG1刺激后HER3膜表達增加，細胞增殖明顯。同時，在NRG1同等刺激條件下，加入HER3 Fab組（第3 組）與未加入HER3 Fab 組（第2 組）相比結(jié)果有差異（P=0.07），說明HER3 Fab 抗體可以顯著抑制MDA-MB-453細胞增殖。結(jié)果見圖5。

圖3 不同表達時間點HER3 Fab的表達鑒定

圖4 ELISA檢測HER3 Fab與HER3的結(jié)合

圖5 CCK8檢測HER3 Fab對MDA-MB-453細胞增殖的抑制性

3 討論

目前哺乳動物細胞表達抗體的2 種形式是瞬時轉(zhuǎn)染和構(gòu)建穩(wěn)定細胞系。一般在大量生產(chǎn)抗體類蛋白應(yīng)用于試劑盒開發(fā)或抗體藥物時，會使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式，但實驗研究新的抗體時一般采用瞬時轉(zhuǎn)染的方式。瞬時轉(zhuǎn)染表達抗體一般是將抗體的輕鏈和重鏈分別構(gòu)建到2 種載體上，再通過轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染到同一細胞中，細胞分別翻譯出輕、重鏈，再在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過二硫鍵將輕、重鏈合成為抗體形式。

一般情況下，293E 哺乳動物懸浮細胞表達抗原蛋白時僅需要3 d，而表達抗體類蛋白時需要4～6 d。在本實驗中，我們驗證了蛋白在不同表達時間的表達水平，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后第3 d 抗體開始表達，并隨著時間的延長表達水平逐漸提高但細胞活率逐漸下降，在第5和第6 d抗體的表達量水平一致。考慮到細胞活率，我們在第5 d 時收取細胞上清純化蛋白。

HER3 屬于酪氨酸激酶受體家族，經(jīng)配體刺激后觸發(fā)構(gòu)型改變并與該家族中其他成員EGFR、HER2，特別是HER2 形成異源二聚體。NRG1 是促發(fā)HER3 下游通路激活的重要因子之一，多種與HER3 抗體研究有關(guān)的實驗設(shè)計都用NRG1 刺激靶細胞。在本研究中，我們還設(shè)置了在未經(jīng)NRG1 刺激的情況下加入HER3 Fab 的組別，結(jié)果顯示該條件下Fab 抗體的孵育對細胞增殖無影響，但是在刺激情況下Fab顯著抑制細胞增長，該現(xiàn)象與HER3的膜表達量呈正相關(guān)，與文獻報道相符。

綜上，我們構(gòu)建、表達并純化獲得了平衡解離常數(shù)KD為1.08×10-8mol/L 的靶向人HER3 的Fab 型抗體，其在NRG1 刺激下對MDA-MB-453 細胞的增殖有一定的抑制能力，這為后期對HER3 高表達型癌癥的研究和診斷提供了一種新的思路與方法。

[1]Schoeberl B,Faber A C,Li D,et al.An ErbB3 antibody,MM-121,is active in cancers with ligand dependent activation[J].Cancer Res,2010,70(6):2485-2494.

[2]Kugel C H 3rd,Hartsough E J,Davies M A,et al.Functionblocking ERBB3 antibody inhibits the adaptive response to RAF inhibitor[J].Cancer Res,2014,74(15):4122-4132.

[3]Ma J,Lyu H,Huang J,et al.Targeting of erbB3 receptor to overcome resistance in cancer treatment[J].Mol Cancer,2014,13:105.

[4]Meetze K,Vincent S,Tyler S,et al.Neuregulin 1 expression is a predictive biomarker for response to AV-203,an ERBB3 inhibitory antibody,in human tumor models[J].Clin Cancer Res,2015,21(5):1106-1114.

[5]Aurisicchio L,Marra E,Roscilli G et al.The promise of anti-ErbB3 monoclonals as new cancer therapeutics[J].Oncotarget,2012,3(8):744-758.

[6]Roque C,Sheung A,Rahman N,et al.Effect of polyethylene glycol conjugation on conformational and colloidal stability ofa monoclonal antibody antigen-binding fragment(Fab')[J].Mol Pharm,2015,12(2):562-575.

[7]Hristodorov D,Mladenov R,Brehm H,et al.Recombinant H22(scFv) blocks CD64 and prevents the capture of anti-TNF monoclonal antibody[J].MAbs,2014,6(5):1283-1289.

[8]Gu J,Lei Y,Huang Y,et al.Fab fragment glycosylated IgG may play a central role in placental immune evasion[J].Hum Reprod,2015,30(2):380-391.

[9]Shukra A M,Sridevi N V,Chandran D,et al.Production of recombinant antibodies using bacteriophages[J].Eur J Microbiol Immunol,2014,4(2):91-98.

[10]Zhang J,Zhang X,Liu Q,et al.Mammalian cell display for rapid screening scFv antibody therapy[J].Acta Biochim Biophys Sin,2014,46(10):859-866.

[11]陳薇,張晶,劉強,等.VEGF 全長抗體在畢赤酵母中的表達與活性鑒定[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(4):492-496.