程陽，唐橋斐，趙麗妮

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034;2.附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室)

MTA1基因最初是1994年Toh等［1］應(yīng)用13762NF 鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移系統(tǒng)通過差異cDNA 文庫篩選分離的轉(zhuǎn)移候選基因。既往的臨床研究表明MTA1 基因的高表達與食道癌［2］、直腸癌［3］、肝癌［4］、胰腺癌［5］、胃癌［3］、乳腺癌［6］、卵巢癌［7］的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān);目前對該基因在下咽癌的組織中的表達情況及與下咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究鮮見，本實驗檢測了MTA1 mRNA 在下咽癌組織中的表達情況，探討其表達水平與下咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取解放軍四六三醫(yī)院耳鼻咽喉科2012年1 月至2014年3 月下咽癌住院手術(shù)病例，共17例。其中梨狀窩癌12例，環(huán)后區(qū)癌2例，下咽后壁區(qū)癌3例。其中男15例，女2例，年齡34～85 歲，按國際抗癌協(xié)會(UICC)TNM 分類標(biāo)準(zhǔn)(1997)修訂的方案，其中T 分級按國際抗癌協(xié)會(UICC)TNM 分類標(biāo)準(zhǔn)(1997)，N 分級按術(shù)后病理結(jié)果劃分。各組均無遠隔器官轉(zhuǎn)移。全部病例組織學(xué)類型均為鱗癌。見表1。全組病例均行手術(shù)治療，術(shù)前未接受放療及化療。取下咽部正常黏膜組織8例(術(shù)中取正常切緣，全組病例均行頸廓清術(shù)，選擇性廓清2例，根治性廓清15例。經(jīng)HE 染色證實為正常黏膜)作為對照。

表1 下咽癌T、N 分級情況

1.2 取材方法 術(shù)中切取新鮮離體癌組織癌灶中心部分，大小約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm 組織塊。下咽正常組織取自安全緣以外，體積同上。將各組織塊分別投入1.5 ml Eppendorf 管，立即置入－179 ℃液氮中速凍，并轉(zhuǎn)入－80 ℃深凍冰箱中保存?zhèn)溆?。對下咽癌頸廓清標(biāo)本，通過透明淋巴結(jié)摘出連續(xù)切片法［8］進行病理觀察，確定轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組。

1.3 試劑及儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Super-script Tm(Promega 產(chǎn)品)。引物序列:MTA1 為5'-AGC-TACGAG-CAG-CAC-AAC-GGG-GT-3'，5'-CAC-GCT-TGGTTT-CCG-AGA-GT-3'，內(nèi)對照 β-actin:5'-ACCCCG-ACT-GAA-AAA-GAT-GA-3'，5'-ATC-TTCAAA-CCT-CCA-TGA-TC-3' (上海博亞生物技術(shù)有限公司/BIOASIA 產(chǎn)品)。其它耗損材料均購自Promega 公司。PCR 擴增儀:PTC-200TM 型 (美國)。

1.4 檢測方法 本研究采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法。

1.4.1 RNA 的提取 從每一個Eppendorf 管中分別取0.1 g 冰凍組織，在低溫下迅速粉碎，采用Trizol 試劑(Promega 產(chǎn)品)，一步法提取總RNA，按說明書進行。

1.4.2 RT-PCR (1)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript Tm，按說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反應(yīng)條件:4 ℃1 h，99 ℃5 min，4 ℃保存。反應(yīng)體系:RNA (1 μg)2 μl，10 × RT buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl24 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(15 U)0.75 μl，Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl，OligodT primer (0.5 μg)1 μl。(2)加ddH2O 稀釋至100 μl。(3)PCR 擴增:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行PCR 擴增。反應(yīng)體系:cDNA 3 μl，10 ×PCR 緩沖液2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，Taq 酶 (5 U/ml)0.4 μl，MTA1 引 物(上下游)10 μmol/L 各0.5 μl，內(nèi)對照β-actin 引物各0.5 μl，加ddH2O 至20 μl。于PCR 擴增儀循環(huán)30個周期。擴增條件:94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后一個周期延伸9 min，4 ℃保存，β-actin 為內(nèi)對照同時擴增。

取PCR 產(chǎn)物7 μl，于8%聚丙酰胺凝膠電泳分離，乙醇固定，硝酸銀染色，觀察結(jié)果并拍照記錄。MTA1 及β-actin 的擴增片段分別為290 bp 和540 bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行相關(guān)統(tǒng)計分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)RT-PCR 方法檢測后，在290 bp 處顯帶的為MTA1 基因，可見在下咽癌轉(zhuǎn)移組和不伴轉(zhuǎn)移組中均有MTA1 mRNA 的表達，而在正常黏膜組織組中無MTA1 mRNA 的表達。MTA1mRNA 在下咽癌轉(zhuǎn)移組表達陽性率為90.9% (10/11);在不伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的其它下咽癌組織及8例癌旁正常黏膜中MTA1 mRNA 的表達率分別為33.3%(2/6)和0%。轉(zhuǎn)移組的表達率與其他2 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。作為內(nèi)對照的β-actin 為540 bp，表達恒定。見圖1 和圖2。

圖1 MTA1 mRNA 在標(biāo)本中的表達情況

3 討論

圖2 內(nèi)對照β-actin 在標(biāo)本中均有恒定表達

2000年Nawa等［9］在人類的2 種乳腺癌轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中同時發(fā)現(xiàn)mta1 相關(guān)序列MTA1。后者與前者有很大的相似處，核苷酸和氨基酸序列分別有88%和90%的一致性。應(yīng)用熒光原位雜交方法發(fā)現(xiàn)MTA1 基因定位于染色體14q32.3［10］;MTA1 基因在具有浸潤性的細胞株中的表達水平是不具有浸潤性的細胞株的2 倍［1］;抗MTA1 基因的反義寡核苷酸可以抑制高表達MTA1 基因mRNA 的乳腺癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，并呈劑量依賴性關(guān)系［11］。

Toh等［3］研究表明，MTA1 mRNA 在38.9%的直腸癌中有過表達現(xiàn)象;在38.2%的胃癌中也同樣發(fā)生了過度表達現(xiàn)象，并且伴隨著升高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率;半定量RT-PCR 結(jié)果顯示，MTA1 mRNA 的表達水平在發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織與無轉(zhuǎn)移的癌組織和癌旁正常黏膜相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;隨后Toh等［2］在食道癌中的研究結(jié)果同上，說明除了腺癌、鱗癌中也存在MTA1 mRNA 過表達的現(xiàn)象。

本研究結(jié)果表明，在17例下咽癌轉(zhuǎn)移組的癌組織中，MTA1 mRNA 表達陽性率為90.9% (10/11);在不伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下咽癌組織及8例癌旁正常黏膜中MTA1 mRNA 的表達率分別為33.3% (2/6)和0%。轉(zhuǎn)移組的表達率與其他2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＜0.01)。說明MTA1 mRNA 的表達與下咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究與文獻報道的結(jié)果都證實了MTA1 基因的表達差異與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，證明了MTA1 基因是一個有巨大潛在臨床價值的指標(biāo)，若應(yīng)用于臨床實踐，可以幫助診斷下咽癌的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

MTA1 基因產(chǎn)物可能通過調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄水平來參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［12］;MTA1 促進腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的另一種可能機制是通過基因表達的改變使細胞間連接發(fā)生缺失，同時，基因表達的改變或基因使腫瘤細胞的惡性程度發(fā)生改變，演變?yōu)榫哂星忠u和轉(zhuǎn)移能力的狀態(tài)，使腫瘤細胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移［13］。但到目前為止，MTA1 基因參與轉(zhuǎn)移過程的確切機理尚未研究清楚。

［1］Toh Y，Pencil SD，Nicolson GL.A Novel candidate metastasis-associated gene，mtal，differentially expressed in high metastatic mammary adenocarcinoma cell line.cDNA cloning，expression，and protein analyses ［J］.J Biol Chem，1994，269(37):22958－22963.

［2］Toh Y，Kiwano H，Mori M，et al.Overexpression of metastasis-associated MTA1mRNA in invasive oesophageal carcinomas［J］.Br J Carcer 1999，79 (11－12):1723－1726.

［3］Toh Y，Oki E，Ods S，et al.Overexpression of MTA1 gene in gastrointestinal carcinoma correlation with invasion and metastasis［J］.Int J Cancer，1997，74 (4):459－463.

［4］林川，陳漢，吳孟超，等.腫瘤轉(zhuǎn)移基因MTA1 的分子克隆及其在肝癌組織中表達的初步研究［J］.中華普通外科雜志，2000，15 (10):634.

［5］Iguchi H，Imura G，Toh Y，et al.Expression of MTA1，a metastasis-associated gene with histone deacetylase activity in pancreatic cancer ［J］.Int J Oncol，2000，16 (6):1211－1214.

［6］Nicolson GL.Breast cancer metastasis-associated genes:role in tumour progression to the metastatic state ［J］.Biochem Soc Symp，1998，63:231－243.

［7］黃光琦，宋毅，賀國麗.MTA1、nm23H1mRNA 表達及突變與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.中華腫瘤雜志，2001，23 (1):31－34.

［8］關(guān)超，于靖寰.喉癌頸廓清透明淋巴結(jié)摘出連續(xù)切片法［J］.耳鼻咽喉頭頸外科，1995，2 (3):192.

［9］Nawa A，Nishimori K，Lin P，et al.Tumor human MTA1 gene:its deduced protein sequence，localization，and association with breast cancer cell proliferation using antisense phosphorothioate oligonucleotides ［J］.J Cell Biochem，2000，79(2):202－212.

［10］Cui Q，Takiguchi S，Matsusue K，et al.Assignment of the human metastasis-associated gene 1 (MTA1)to human chromosome band 14q32.3 by fluorescence in situ hybridization ［J］.Cytogenet Cell Genet，2001，93 (1－2):139－140.

［11］Martin MD，F(xiàn)ischbach K，Osborne CK，et al.Loss of heterozygosity events impeding breast cancer metastasis contain the MTA1 gene ［J］.Cancer Res，2001，61 (9):3578－3580 .

［12］Anisha S，Jouni U，Ulrich R，et al.Different expression and subcellular distribution of the mouse metastasis-associated proteins MTA1 and MTA3 ［J］.Gene，2001，273 (1):29－39.

［13］Nicolson GL，Moustafa AS.Metastasis-associated genes and metastatic tumor progression ［J］.In Vivo，1998，12 (6):579－588.