李進霞，于肯明，張慧芝，閆燕艷，孫樹茂

（山西大同大學醫(yī)學院,山西大同037009）

芹菜素-環(huán)糊精包合物在溶液中的制備、表征及抗氧化性

李進霞，于肯明，張慧芝，閆燕艷，孫樹茂

（山西大同大學醫(yī)學院,山西大同037009）

目的研究芹菜素與β-環(huán)糊精及羥丙基-β-環(huán)糊精在溶液中形成包合物的過程，并對其包合過程進行表征及抗氧化活性的研究。方法采用熒光光譜法研究芹菜素與環(huán)糊精在溶液中的形成過程。采用熒光光譜法及相溶解度法研究所形成的包合物的包合常數(shù)及在溶液中的溶解度。通過測定抑制自由基DPPH?的氧化率，比較芹菜素及其包合物的抗氧化活性。結(jié)果芹菜素與環(huán)糊精形成了1∶1的包合物，其中芹菜素與羥丙基-β-環(huán)糊精的包合能力強于β-環(huán)糊精。形成的包合物抗氧化能力大大增強，其中芹菜素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的抗氧化能力強于β-環(huán)糊精。結(jié)論芹菜素與環(huán)糊精形成的包合物可以增加芹菜素的溶解度及抗氧化活性，擴大了芹菜素的臨床的應(yīng)用范圍。

芹菜素；環(huán)糊精；熒光光譜；DPPH?

芹菜素（Apigenin，AP,4’,5,7-三羥基黃酮，圖1），存在于許多植物與水果中，作為許多疾病的重要飲食來源和潛在的治療藥物來源備受關(guān)注，比如在炎癥，抗氧化作用，一些癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、白血病、胰腺癌、卵巢癌等[1-3]的治療中均起到了重要作用。此外，芹菜素還可以影響許多生物膜的活性[4-7]。然而，由于芹菜素溶解度差的物理化學性質(zhì)及其不宜制成液體制劑注射給藥等的生物制藥特性限制了其在臨床的應(yīng)用。

環(huán)糊精（CDs）是由6～8個右旋單糖分子以α-1，4鍵相連結(jié)合形成的環(huán)狀多糖超分子化合物，其外部親水而內(nèi)部疏水，疏水的空腔在水溶液中具有容納其他形狀和大小適合的疏水性物質(zhì)的分子、離子或基團嵌入洞中形成包合物。環(huán)糊精的包合作用已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于制藥工業(yè)及分析領(lǐng)域。另外，由于環(huán)糊精與物質(zhì)之間的作用與機體蛋白質(zhì)、酶的作用非常相似，臨床上將環(huán)糊精作為蛋白質(zhì)、酶的模型來研究[8]。尤其，環(huán)糊精與藥物分子包合以后可以改變藥物分子的理化性質(zhì)及生物學特性而被廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)，例如增加母體藥物的溶解度、化學穩(wěn)定性、生物利用度，降低母體藥物的毒副作用，還具有緩控釋作用等等[9]。

芹菜素與生物分子的包合作用已經(jīng)被研究[10]，而其與環(huán)糊精的包合作用還沒有相關(guān)報道。本文對芹菜素與環(huán)糊精及其衍生物的包合進行研究，將對芹菜素的臨床藥物制備及臨床藥物應(yīng)用提供理論指導。

圖1 芹菜素分子的化學結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜素(色譜純，HLPC≥98%，南京廣潤生物制品有限公司)用無水乙醇溶解并稀釋成濃度為1.0×10-4mol∕L作為儲備液；β-環(huán)糊精（β-CD），羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，上海源葉生物科技有限公司）用蒸餾水配成濃度為1.0×10-2mol∕L的溶液；DPPH?（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇 (分析純)、Mg(Ac)2?2H2O(分析純)及氨水均為市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504 PC分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；F-2500熒光分光光度計（HITACHI），1 cm石英池，狹縫寬度為5 nm，激發(fā)波長為270 nm，發(fā)射波長大約為330 nm。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

分別移取1 mL的芹菜素儲備液于10個10 mL的刻度管中，再分別加入0～9 mL的環(huán)糊精溶液，混合，用超純水稀釋至刻度，在室溫下超聲6 h，平衡過夜，溶液分別采用熒光法進行分析。

1.3.2 相溶解度的研究

相溶解度法用于測定包合物的溶解度和包合常數(shù)。將過量的芹菜素（8 mg）加入到一系列10 mL的比色管中，比色管內(nèi)含有系列濃度的環(huán)糊精（1.0×10-2mol∕L,0～ 9 mL,包括β-CD和HP-β-CD）。混合物用蒸餾水稀釋到刻度，室溫條件下超聲處理6 h，室溫下放置7 d，用G4沙星漏斗抽濾，濾液被稀釋后紫外分析。包合常數(shù)通過下列公式計算：

其中，S0是室溫條件下不加環(huán)糊精時芹菜素的溶解度，slope是相溶解度曲線中相應(yīng)的斜率。

1.3.3 自由基清除率的研究

通過對穩(wěn)定自由基DPPH?的清除率來研究抗氧化活性的大小。

DPPH?分別用甲醇和乙醇配制成濃度為1.0×10-4mol∕L的儲備液。儲備液分別用鋁箔紙包裹存放于暗處。

分別取1 mL DPPH?儲備液置于10個10 mL比色管中，各加入3 mL濃度為1.0×10-2mol∕L的環(huán)糊精溶液（包括β-CD和HP-β-CD）和1～9 mL的芹菜素溶液，最終用甲醇或乙醇稀釋至刻度，充分混勻后在室溫下平衡30 min，用乙醇溶液或甲醇溶液做空白對照，分別在517 nm的吸收波長處測定其吸收度的值。結(jié)果用DPPH?的百分清除量計算，公式如下：

其中，I為自由基清除活性，Asample為樣品的吸收度的值，Ablank為不加DPPH?的空白溶液的吸收度的值，Acontrol為DPPH?的吸收度的值。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜法

圖2顯示了游離芹菜素和芹菜素-環(huán)糊精包合物的熒光光譜。激發(fā)波長均為270 nm，芹菜素-HP-β-CD包合物的最大發(fā)射波長分別是326 nm和335 nm；芹菜素-β-CD包合物的最大發(fā)射波長分別是299 nm和324 nm。從圖可以看出，隨著CDs濃度的增加，其發(fā)射峰增強。所有數(shù)據(jù)顯示，芹菜素和CDs之間形成了穩(wěn)定的包合物。環(huán)糊精內(nèi)腔為芹菜素分子提供了一個非極性的環(huán)境，使芹菜素的熒光量子產(chǎn)率增加。

芹菜素與環(huán)糊精形成包合物的包合常數(shù)（Ks）通過改良的Benesi-Hildebrand方程計算得到。

圖2 芹菜素-環(huán)糊精包合物的熒光光譜

1 ∕(F-F0)與1∕(CD)形成的雙倒數(shù)曲線如圖3所示，其線性關(guān)系良好。從圖中可以看出，芹菜素和環(huán)糊精形成了1∶1的包合物。包合常數(shù)（Ks）見表1?？梢缘玫?，芹菜素與HP-β-CD的包合常數(shù)大于與β-CD的包合常數(shù)，表明芹菜素更適合于HP-β-CD形成包合物。

圖3 1/(F-F0)與1/[CD]的雙倒數(shù)曲線

表1 芹菜素與環(huán)糊精包合物的相對包合常數(shù)

2.2 相溶解度研究

圖4為芹菜素與環(huán)糊精形成包合物的相溶解度圖。可以看出，芹菜素同樣和環(huán)糊精形成1∶1的包合物，其線性關(guān)系良好，包合常數(shù)見表2所示，包合能力HP-β-CD大于β-CD。環(huán)糊精可以增加芹菜素在水溶液中的溶解度。

圖4 芹菜素和環(huán)糊精包合物的相溶解度圖。

表2 芹菜素與環(huán)糊精形成包合物的包合常數(shù)

2.3 自由基清除率研究

自由基清除率用藥物抑制自由基DPPH?氧化能力的大小來表示。自由基DPPH?在甲醇和乙醇中的紫外吸收如圖5所示。自由基DPPH?在甲醇溶液中的吸收度值高于在乙醇溶液中的吸收度值，說明DPPH?在甲醇溶液中對紫外吸收的敏感性更高。然而在乙醇溶液中線性關(guān)系（r2=0.999 0）優(yōu)于在甲醇溶中的線性關(guān)系（r2=0.995 4），因此，實驗選擇乙醇作為自由基DPPH?的溶劑。實驗檢測濃度范圍為20～60μmol∕L，吸收度值范圍在0.221～0.735之間。

芹菜素及芹菜素-環(huán)糊精包合物抑制自由基氧化能力的實驗如圖6所示。在實驗研究濃度范圍內(nèi)，芹菜素、芹菜素-β-CD包合物和芹菜素-HP-β-CD包合物對自由基的平均清除率分別為59.6%,75.4%和99.1%。抑制自由基DPPH?氧化的因素包括反應(yīng)媒介的極性和pH，游離基清除劑的化學結(jié)構(gòu)等，另外，酚類藥物的抗氧化能力還與藥物分子中羥基化程度，羥基所在的位置及多羥基群有關(guān)，藥物的抗氧化能力可被另外的羥基群所增強。因而，芹菜素與環(huán)糊精形成包合物后，芹菜素分子中的羥基與環(huán)糊精分子中的羥基群相互作用可以使包合物的抗氧化能力大大增強。

芹菜素，芹菜素-環(huán)糊精包合物對自由基的氧化抑制時間曲線如圖7所示?？梢钥闯?，藥物對抗自由基的氧化作用是瞬間完成的，在實驗測試時間范圍內(nèi)抗自由基氧化能力的大小順序是：芹菜素-HP-β-CD＞芹菜素-β-CD＞芹菜素。

圖5 自由基DPPH?在甲醇溶液和乙醇溶液中的紫外吸收圖

圖6 3種物質(zhì)的自由基清除率

圖7 抗自由基清除時間曲線圖

3 結(jié)論

本研究表明，芹菜素和環(huán)糊精（包括-β-CD和HP-β-CD）在溶液中形成了1∶1的包合物，其中芹菜素與HP-β-CD的包合能力強于芹菜素與β-CD的包合能力。形成的包合物在溶液中的溶解度和抗氧化能力均增強，其中芹菜素與HP-β-CD形成的包合物其溶解度及抗氧化能力均比芹菜素與β-CD形成的包合物的溶解度及抗氧化能力強，擴大了臨床芹菜素的應(yīng)用范圍和藥物制劑范圍。

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〔責任編輯 楊德兵〕

Preparation,Characterization and Antioxidant Activity of the Inclusion Complex of Apigenin with β-Cyclodextrin and HP-β-Cyclodextrin in Solution

LI Jin-xia,YU Ken-ming,ZHANG Hui-zhi，YAN Yan-yan,SUN Shu-mao

（Medical School，Shanxi Datong University,Datong Shanxi，037009）

Objective To determine the interaction of AP with β-cyclodextrin(β-CD)and 2-hydroxylpropyl(HP)- β-CD in detail based on fluorescence method and to determine the effect of the complex process on their antioxidant capacity.Methods The formation of the complexes of apigenin(AP)with ?-cyclodextrin(β-CD)and 2-hydroxylpropyl(HP)-?-CD was studied by fluorescence spectra in solution.The formation constants(Ks)of complexes were determined by fluorescence method and phase-solubility measurements.Results The results showed that the inclusion ability of β-CD and its derivative were the order:HP-β-CD＞β-CD.In addition,the experimental resulted confirmed the existence of 1:1 inclusion complex of AP with CDs.Kinetic studies of scavenging of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical(DPPH?)with AP and CDs complexes were done.Conclusion The results obtained indicated that the AP∕HP-β-CD complex was the most reactive form,then was β-CD complex,and last was free AP.

apigenin;cyclodextrins;fluorescence;DPPH?

R914.1

A

1674-0874(2015)06-0040-04

2015-09-05

山西大同大學校級青年基金[2012Q4]

李進霞（1979-），女，山西應(yīng)縣人，碩士，講師，研究方向：中藥有效成分的包合。