董志軍，張鐵民，付笑笑，陶相宜，王東華

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德　067000）

菩人丹對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜HO-1表達(dá)的作用

董志軍，張鐵民△，付笑笑，陶相宜，王東華

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德067000）

目的：探討菩人丹（PRD）對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血紅素加氧酶l（HO-1）表達(dá)的影響。方法：36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，模型成功建立后，PRD治療組大鼠給予PRD（1.8g/kg/d）灌胃3個(gè)月。分別采用Western blot法和RT-PCR法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P＜0.01），PRD治療組大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯高于模型組大鼠（P＜0.01）。結(jié)論：PRD可通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)減輕糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用。

菩人丹；糖尿病視網(wǎng)膜病變；血紅素加氧酶l

目前，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的發(fā)病率逐年升高，是造成視力損害的主要原因［1-2］。近年的研究表明，DR與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。血紅素加氧酶l（Heme oxygenase-1，HO-1）是一種抗氧化防御酶，參與細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷［3］。菩人丹（Purendan superfine powder，PRD）是由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭組成的中藥復(fù)方，具有益氣養(yǎng)陰清熱、活血化瘀通絡(luò)的功效。本研究通過(guò)觀察PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜HO-1表達(dá)的影響，探討PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑：PRD超微粉，河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)有限公司代加工生產(chǎn)；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美國(guó)Sigma公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen公司；HO-1兔抗多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HO-1引物，上海生工公司；蛋白定量試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性Wistar大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2006-0009），體質(zhì)量200-250g。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組、模型制備與給藥：36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組和PRD治療組大鼠均采用2% STZ（25mg/ kg/d，3d）連續(xù)腹腔注射的方法建立糖尿病動(dòng)物模型，以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。模型成功建立后，模型組大鼠不再做任何處理；PRD治療組大鼠給予PRD（1.8g/kg/d）灌胃3個(gè)月。

1.2.2標(biāo)本制備：給藥結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5g/kg）大鼠，迅速取出眼球，在動(dòng)物手術(shù)顯微鏡下冰面上鈍性分離視網(wǎng)膜，投入液氮中保存。

1.2.3Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜HO-1蛋白的表達(dá)：取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織提取蛋白質(zhì)，BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育；Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析，以HO-1條帶與β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜HO-1mRNA的表達(dá)：取液氮中保存的視網(wǎng)膜組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃，2min；94℃，30sec；50℃-65℃，30sec；72℃，1min，第二步起循環(huán)。HO-1引物序列為：F：5’CAGT CTATGCCCCACTCTAC3’R：5’AAGGCGGTCTTAGCCTC TTC3’，退火溫度為59℃，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小406bp；βactin引物序列為：F：5’CATCCTGCGTCTGGACCT3’，R：5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’，退火溫度為58℃，29個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小480bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，并用Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶的光密度與β-actin條帶光密度的比值，作為目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

2　結(jié)果

2.1HO-1蛋白的表達(dá)情況在蛋白Marker的32KD、43KD水平處，分別可見HO-1蛋白條帶和β-actin條帶。糖尿病模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；PRD治療組與模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見附表。

2.2HO-1 mRNA的表達(dá)情況在DNA Marker的406bp、 480bp水平處分別可見HO-1和β-actin mRNA條帶糖尿病模型組與正常對(duì)照組比較，大鼠視網(wǎng)膜HO-1 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；PRD治療組與模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜HO-1 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見附表：

附表　各組大鼠視網(wǎng)膜HO-1的表達(dá)（±s）

附表　各組大鼠視網(wǎng)膜HO-1的表達(dá)（±s）

與正常對(duì)照組比較：1）P＜0.01；與糖尿病模型組比較：2）P＜0.01

組別nHO-1蛋白HO-1 mRNA正常對(duì)照組120.2348±0.01190.1965±0.0091糖尿病模型組120.5067±0.06051）0.4987±0.03061）PRD治療組120.9396±0.03942）0.8976±0.01532）

3　討論

HO是血紅素分解的限速酶，具有三種同工酶，其中HO-1又稱為熱休克蛋白32，是參與組織細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)性因子［4］。HO-l主要分布在血細(xì)胞代謝活躍的組織器官，在眼的晶狀體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜廣泛分布。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可以保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中HO-1高表達(dá)具有抗炎、抗氧化損傷、抗細(xì)胞凋亡、抗增生等保護(hù)作用［5-6］。本研究成功建立了2型糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平較正常組升高，表明糖尿病時(shí)慢性高血糖引起了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織缺氧并造成了氧化應(yīng)激損傷，抗氧化蛋白增加，激活了抗氧化應(yīng)激通路。

PRD是針對(duì)糖尿病病機(jī)關(guān)鍵“熱、虛、瘀”的組方。本方以苦瓜（《廣東新語(yǔ)》又稱菩達(dá)）清解郁熱；人參、丹參葛根益氣生津、活血化瘀；制首烏補(bǔ)益精血，固腎益陰；水蛭祛瘀消，剔邪搜絡(luò)。諸藥協(xié)同，益氣養(yǎng)陰，調(diào)暢氣血，化瘀通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，PRD具有抑制氧化應(yīng)激、對(duì)抗細(xì)胞凋亡、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織修復(fù)與再生等作用［7-9］本研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病模型組比較，PRD組大鼠視網(wǎng)膜HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)進(jìn)一步升高，這說(shuō)明PRD可以通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)水平從而減輕糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度，發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用，但PRD調(diào)控HO-1表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。由于PRD避免了化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)，因此可能為DR的治療提供新方法。

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EFFECTS OF PURENDAN ON EXPRESSION OF HO-1 IN RETINA OF DIABETIC RATS

DONG Zhi-jun， ZHANG Tie-min， FU Xiao-xiao， et al
（Department of Ophthalmology， the Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To investigate the effects of Purendan （PRD） on heme oxygenase-1 （HO-1） expression in retina of diabetic rats. Methods: 36 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups （n=12）： normal control group，diabetes model group，PRD treatment group. The diabetes model rats were made by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. After the diabetes animal model was successfully established， the rats in PRD treatment group were lavaged with PRD （1.8g/kg/d）for 3 months. Western blot and RT-PCR were respectively used to detect the expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats. Results: The expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats in diabetes model group were obviously higher than normal control rats （P＜0.01）. Compared with diabetes model rats， the expression of HO-1 protein and mRNA in retina of rats in PRD treatment group increased signifi cantly （P＜0.01）. Conclusions: PRD can reduce oxidative stress injury in retina by up-regulating HO-1 expression in retina， thus has protective effects on diabetic retinopathy.

Purendan； Diabetic retinopathy； Heme oxygenase-1

R774.1

A

1004-6879（2015）06-0472-03

2015-03-10）

（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏）