伏晨卉，張彥彥，苗玉倩，孫明麗，孔學(xué)敏，王麗娜

（1.承德醫(yī)學(xué)院2011級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德　067000；2.指導(dǎo)教師）

學(xué)生園地

不同轉(zhuǎn)種密度對(duì)體外培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng)效果的影響

伏晨卉1，張彥彥1，苗玉倩1，孫明麗1，孔學(xué)敏1，王麗娜2

（1.承德醫(yī)學(xué)院2011級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2.指導(dǎo)教師）

陰道毛滴蟲(chóng)；轉(zhuǎn)種密度；體外培養(yǎng)；肝浸湯培養(yǎng)基

陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis）是人體泌尿生殖系統(tǒng)感染的常見(jiàn)病原體，主要引起滴蟲(chóng)性陰道炎或尿道炎，若不及時(shí)治療，易造成交叉感染和反復(fù)感染，嚴(yán)重影響患者的身心健康［1］。滴蟲(chóng)病是性傳播疾病，有助于HIV的傳播［2］。近年來(lái)，該病有上升的趨勢(shì)，有資料顯示，陰道毛滴蟲(chóng)可以傳染給嬰兒［3-5］。越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)工作者及科研人員致力于陰道毛滴蟲(chóng)的研究，體外培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng)成為科研與教學(xué)中的一項(xiàng)重要基本工作。隨著分子克隆技術(shù)的發(fā)展，陰道毛滴蟲(chóng)的科學(xué)研究達(dá)到新的領(lǐng)域，但其前提是需要分離培養(yǎng)出高質(zhì)量的蟲(chóng)體。目前，體外培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng)的研究報(bào)道頗多，但對(duì)其轉(zhuǎn)種密度的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道［6-9］。因此，為了節(jié)約資源以及達(dá)到最好的觀察和研究效果，找到適合陰道毛滴蟲(chóng)的最適轉(zhuǎn)種密度和最佳生長(zhǎng)時(shí)間尤為重要。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)種采自承德市婦幼保健醫(yī)院婦科門(mén)診滴蟲(chóng)性陰道炎患者的陰道分泌物。采用消毒棉拭子簽在陰道后穹隆處取分泌物，接種于肝浸湯培養(yǎng)基中，37℃無(wú)菌培養(yǎng)，陰道毛滴蟲(chóng)每48h傳代1次，培養(yǎng)3代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1肝浸湯培養(yǎng)基：將兔肝15g剪成小塊，研碎后置于100ml蒸餾水中，然后放入4℃ 冰箱內(nèi)冷浸過(guò)夜，次日加熱煮沸半小時(shí)，用紗布過(guò)濾除去沉渣，再向?yàn)V液中加蒸餾水，以補(bǔ)還加熱時(shí)蒸發(fā)失去的水量，即得澄清的15%肝浸湯。然后加入蛋白胨2g，半胱氨酸鹽酸鹽0.2g，麥芽糖1.0g，氯化鈉0.5g，并加熱使試劑溶解，調(diào)pH為5.6，過(guò)濾，分裝每試管5ml，塞以非脫脂棉花，高壓滅菌后置37℃恒溫箱中24-48h，保存于4℃冰箱中備用。轉(zhuǎn)種前，每管中加入無(wú)菌滅活小牛血清1ml，青霉素和鏈霉素濃度各達(dá)1500U/ml，放溫箱中20min即可轉(zhuǎn)種。

1.2.2蟲(chóng)種準(zhǔn)備：取經(jīng)3代培養(yǎng)的滴蟲(chóng)再培養(yǎng)48h，用吸管從培養(yǎng)管底部吸滴蟲(chóng)懸液3ml，80g離心10min，用血細(xì)胞記數(shù)器記數(shù)蟲(chóng)體后定量。將陰道毛滴蟲(chóng)以不同的轉(zhuǎn)種密度轉(zhuǎn)種至肝浸湯培養(yǎng)基，每管蟲(chóng)數(shù)分別為2.0×104個(gè)/ml、6.0×104個(gè)/ml、10.0×104個(gè)/ml、14.0×104個(gè)/ml、18.0×104個(gè)/ml。每24h顯微鏡下觀察，并比較陰道毛滴蟲(chóng)的活躍度和數(shù)量。

1.2.3實(shí)驗(yàn)觀察與結(jié)果判斷：每隔24h（24h、48h、72h、96h、120h）振蕩搖勻各管，吸取20μl培養(yǎng)物滴于載玻片上，加蓋玻片，鏡檢，高倍鏡下觀察每個(gè)視野蟲(chóng)體的活躍度和存活蟲(chóng)數(shù)，即生長(zhǎng)密度。蟲(chóng)體活躍度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：“++++”為10秒內(nèi)蟲(chóng)體旋轉(zhuǎn)6-10周，搖擺21-30次，鞭毛和波動(dòng)膜運(yùn)動(dòng)活躍；“+++”為10秒內(nèi)蟲(chóng)體旋轉(zhuǎn)1-5周，搖擺11-20次，鞭毛和波動(dòng)膜運(yùn)動(dòng)活躍；“++”為10秒內(nèi)蟲(chóng)體停止旋轉(zhuǎn)，搖擺1-10次，鞭毛擺動(dòng)活躍，波動(dòng)膜運(yùn)動(dòng)不活躍；“+”為蟲(chóng)體變圓，10秒內(nèi)蟲(chóng)體靜止不動(dòng)或搖擺1-5次，鞭毛擺動(dòng)不活躍，波動(dòng)膜停止運(yùn)動(dòng)；“－”為蟲(chóng)體變圓，蟲(chóng)體靜止不動(dòng)，鞭毛和波動(dòng)膜停止運(yùn)動(dòng)。為避免漏檢，如未觀察到活的蟲(chóng)體，則對(duì)陰性培養(yǎng)物再作正常轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，48h后取管底培養(yǎng)物鏡檢，仍未見(jiàn)活的蟲(chóng)體才可判斷為“－”。

2　結(jié)果

不同轉(zhuǎn)種密度陰道毛滴蟲(chóng)在肝浸湯培養(yǎng)基中的繁殖情況（附表）：24h時(shí)生長(zhǎng)密度隨著滴蟲(chóng)密度的增大而逐漸增大，蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)活潑；48h時(shí)，生長(zhǎng)密度均較24h增大，隨著滴蟲(chóng)密度的增大而逐漸增大，14.0×104個(gè)/ml與18.0×104個(gè)/ml的培養(yǎng)基中陰道毛滴蟲(chóng)到達(dá)生長(zhǎng)高峰，生長(zhǎng)密度差別不大，且蟲(chóng)體的活躍度有所下降；2.0×104個(gè)/ml、6.0×104個(gè)/ml與10.0×104個(gè)/ml培養(yǎng)基中的陰道毛滴蟲(chóng)均在72h時(shí)到達(dá)生長(zhǎng)高峰，但10.0×104個(gè)/ml密度蟲(chóng)體活躍度有所下降。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不同密度培養(yǎng)基中的陰道毛滴蟲(chóng)生長(zhǎng)密度均下降明顯，蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)微弱，至120h時(shí)，除2.0×104個(gè)/ml的培養(yǎng)基中還可見(jiàn)活體外，其余培養(yǎng)基中的陰道毛滴蟲(chóng)全部死亡。

3　討論

目前關(guān)于陰道毛滴蟲(chóng)培養(yǎng)研究的報(bào)道較多，其中肝浸湯培養(yǎng)基是最常用的培養(yǎng)基［6，10］。本研究是將從臨床分離的陰道毛滴蟲(chóng)培養(yǎng)到最佳狀態(tài)時(shí)，以不同的接種量轉(zhuǎn)種至肝浸湯培養(yǎng)基，觀察并比較陰道毛滴蟲(chóng)的增殖情況，探索陰道毛滴蟲(chóng)的最適轉(zhuǎn)種密度和處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的時(shí)間。

附表　肝浸湯培養(yǎng)基體外培養(yǎng)陰道毛滴蟲(chóng)的效果比較

本研究中，陰道毛滴蟲(chóng)剛轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基，由于條件適宜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富及pH值合適，所以生長(zhǎng)狀況較好，繁殖較快。隨著蟲(chóng)體的數(shù)量增加，密度增大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗增多，培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸缺乏，乳酸等代謝產(chǎn)物隨之增加，使pH降低，環(huán)境的變化使陰道毛滴蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)蟲(chóng)體大量死亡、裂解，最終培養(yǎng)基中無(wú)活體，鏡檢為陰性。不同密度的陰道毛滴蟲(chóng)在肝浸湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)為先迅速繁殖，到達(dá)高峰后下降，活躍度也隨之下降。陰道毛滴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)種密度越低，到達(dá)生長(zhǎng)高峰的時(shí)間越長(zhǎng)；轉(zhuǎn)種密度越高到達(dá)生長(zhǎng)高峰的時(shí)間越短，但10.0×104個(gè)/ml、14.0×104個(gè)/ml與18.0×104個(gè)/ml的培養(yǎng)基中陰道毛滴蟲(chóng)到達(dá)生長(zhǎng)高峰時(shí)，蟲(chóng)體活躍度已經(jīng)下降。

綜合比較，肝浸湯培養(yǎng)基中陰道毛滴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)種密度為10.0×104個(gè)/ml時(shí)，生長(zhǎng)繁殖速度非?？欤?8h時(shí)生長(zhǎng)密度較大，活躍度最好，適合教學(xué)與科研，但是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，需48h就得轉(zhuǎn)種，浪費(fèi)物資和人力。肝浸湯培養(yǎng)基中陰道毛滴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)種密度為6.0×104個(gè)/ml時(shí)生長(zhǎng)繁殖速度相對(duì)較緩，72h時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，所以可72h進(jìn)行轉(zhuǎn)種，既節(jié)約成本，又不浪費(fèi)人力，適合長(zhǎng)期保種。在實(shí)際工作中，可根據(jù)不同的需要選擇適合的轉(zhuǎn)種密度。

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（學(xué)生園地欄目編輯：張健）

R382.2

A

1004-6879（2015）06-0536-02

2015-01-26