姚 曼，梁淑芳，程彬彬，凌昌全*

(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海200433)

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid, GC）廣泛應(yīng)用于臨床， 用于治療多種慢性炎性及自身免疫性疾病。 然而長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，常常會引起很多副作用，其中，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（Glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP）就是其最嚴重的副作用之一。 有研究表明，在接受GC 治療超過6個月的患者中， 約有30%會發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[1]；而長期接受GC 治療的成年患者中約有30%～50%發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[2]，因此，積極防治GIOP 對臨床長期接受GC 治療的患者具有重要意義。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)， 人參皂苷（Ginsenoside，GSS）能夠拮抗糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的大鼠骨質(zhì)疏松癥[3]。鑒于對骨形成的抑制是GIOP 發(fā)生的關(guān)鍵作用機制，因此，我們在體外初步觀察了對成骨細胞增殖的影響，并探討了其作用機制。

1 實驗材料

1.1 試驗藥物

人參總皂苷按報道的方法由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院采用乙醇回流法提取[4]，純度＞95%。 用DMSO 溶解后儲存于-20 ℃。

1.2 細胞株

MC3T3-E1 小鼠成骨細胞系購自中科院上海細胞所。

1.3 試劑

αMEM 培養(yǎng)基購自Thermo Scientific 公司，二甲基亞砜購自美國AMRESCO 公司，胎牛血清購自法國Biowest 公司，MTT、 臺盼藍購自Sigma-Aldrich，蛋白凝膠試劑盒、Western 及IP 細胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所， 貨號：P0013B）、SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix （TOYOBO、Code：QPK-201）、p21 抗體(No.#2947S)、p27 抗體(No.#3686S)、Cyclin D1 抗體 (No.#2978S) 均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

小 鼠MC3T3-E1 細 胞： 用 含 有10%FBS 的αMEM 完全培養(yǎng)基在37 ℃、 體積分數(shù)為5%的CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48 h 更換培養(yǎng)基，細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA 消化傳代，實驗選用第3～5代對數(shù)生長期細胞。

2.2 MTT 法檢測MC3T3-E1 小鼠成骨細胞增殖水平

取對數(shù)生長期的小鼠成骨細胞MC3T3-E1，胰酶消化后制備單細胞懸液， 以1 500 cell/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。 培養(yǎng)24 h 后，加入含有不同終濃度GSS（3.125～50 μg/mL）的αMEM 完全培養(yǎng)基，空白組加入含等體積DMSO 的αMEM 完全培養(yǎng)基，每孔100 μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后， 每孔加入5 mg/mL 的MTT試劑10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)上清，加入DMSO 溶劑，150 μL/孔， 放于37 ℃恒溫搖床中震蕩10 min， 使沉淀充分溶解后， 置于酶標儀492 nm 上測定波長吸光度OD 值，按以下公式計算增殖率： 增殖率=（實驗組OD 值－本底組OD 值）/（對照組OD 值－本底組OD 值）×100%

2.3 熒光定量RT-PCR 法檢測細胞周期相關(guān)基因表達

取對數(shù)生長期的成骨細胞MC3T3-E1 接種于12 孔板，每孔體積1 mL。 培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的GSS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用Trizol 試劑分別提取各組細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀檢測各組RNA濃度和純度后，進行逆轉(zhuǎn)錄。以生成的cDNA 作為模板進行擴增反應(yīng)， 采用SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix （TOYOBO） 定量檢測各組細胞內(nèi)p21 和p27 mRNA 的表達水平。引物序列見表1。用內(nèi)參進行標準化處理，按照2-ΔΔCт法對基因表達進行相對定量分析。

表1 引物序列

2.4 Western blotting 法檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期的成骨細胞MC3T3-E1 接種于6孔板，每孔體積2 mL。培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的GSS， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后提取總蛋白，BCA 法蛋白定量。 蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，將封閉后的PVDF 膜加入一抗（按1:1 000 稀釋），4℃搖床孵育過夜依次加入辣根過氧化物酶標記的二抗（按1:2000 稀釋），TBST 洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光法進行顯影， 以檢測Cyclin D1 蛋白及細胞周期抑制蛋白p21 及p27 的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對MC3T3-E1 小鼠成骨細胞的影響

結(jié)果顯示， 與空白對照組相比，3.125～50 μg/mL的GSS 在24、48 h 時均能夠顯著促進MC3T3-E1 細胞的增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05），其作用具有時間依賴性和濃度依賴性。 而在GSS 作用72 h 后，僅6.25、12.5 及25 μg/mL 的GSS 組MC3T3-E1 細胞增殖率與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。 見表2。

表2 GSS 對小鼠成骨細胞MC3T3-E1 增殖率（%）的影響（±s）

表2 GSS 對小鼠成骨細胞MC3T3-E1 增殖率（%）的影響（±s）

注：與空白對照組比較*P＜0.05, **P＜0.01。 下表同。

組別Control GSS (50 μg/mL)GSS (25 μg/mL)GSS (12.5 μg/mL)GSS (6.25 μg/mL)GSS (3.125 μg/mL)GSS (1.57 μg/mL)24 h 100.0±1.3 109.6±2.3**105.9±2.2*105.9±4.9*106.8±1.6**105.5±1.6**98.7±0.9 48 h 100.0±0.7 115.3±3.3**117.3±4.0**114.7±7.0**112.8±2.1**110.8±1.1**103.3±1.3 72 h 100.0±5.4 103.0±4.0 107.2±2.7*112.7±6.2**105.4±2.1*108.9±7.1 101.0±4.2

3.2 GSS 對p21 和p27 mRNA 表達水平的影響

結(jié)果顯示，50 和25 μg/mL 的GSS 能夠顯著抑制p21 和p27 的mRNA 表達，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而12.5 μg/mL 的GSS 對p21 和p27 的mRNA 表達水平無明顯下調(diào)， 與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 GSS 對p21 和p27 mRNA 表達水平的影響（n=3,±s）

表3 GSS 對p21 和p27 mRNA 表達水平的影響（n=3,±s）

組別Control GSS (50 μg/mL)GSS (25 μg/mL)GSS (12.5 μg/mL)p21 1.00±0.25 0.50±0.15**0.38±0.12**0.98±0.21 p27 1.00±0.10 0.59±0.22**0.59±0.23**0.94±0.25

3.3 對細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，50、25 μg/mL 的GSS 處理MC3T3-E1 細胞24 h 后， 細胞周期抑制蛋白p21 及p27 表達水平較空白對照組顯著下降(P＜0.01 或0.05)，而Cyclin D1 表達顯著上調(diào)(P＜0.01)。但12.5 μg/mL 的GSS 對P21、P27 及Gyclin D1 蛋白表達較空白對照但比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖1-2，表4。

圖1 不同濃度GSS 對周期抑制蛋白p21 和p27 表達的影響

圖2 不同濃度GSS 對Cyclin D1 表達的影響

表4 GSS 對p21、p27 及Cyclin D1 蛋白表達水平的影響 （n=3,±s）

表4 GSS 對p21、p27 及Cyclin D1 蛋白表達水平的影響 （n=3,±s）

組別Control GSS (50 μg/mL)GSS (25 μg/mL)GSS (12.5 μg/mL)p21 0.172±0.008 0.131±0.002**0.134±0.017**0.166±0.009 p27 0.656±0.058 0.532±0.027**0.550±0.014*0.614±0.027 Cyclin D1 0.571±0.025 0.780±0.027**0.695±0.026**0.528±0.048

4 討論

GC 的生理和藥理作用主要是通過其受體（Glucocorticoid receptor，GR）發(fā)揮的。 GC 與GR 結(jié)合后形成GC-GR 二聚體，GC-GR 二聚體轉(zhuǎn)移到核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用[5]。 研究顯示：藥理劑量的GC 使骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化過程受損，抑制成骨細胞的增殖和分化成熟，進而導(dǎo)致骨形成明顯減少[6]。 此外，GC 還能夠通過促進成骨細胞凋亡導(dǎo)致骨形成減少[7]。 總之，GC 通過抑制成骨細胞增殖和分化，促進骨細胞的凋亡，減少骨形成；并促進破骨細胞分化，增加骨吸收，最終導(dǎo)致GIO 的發(fā)生[8]。

因此，我們首先觀察了GSS 對成骨細胞增殖的作用。 結(jié)果顯示，GSS 作用不同時間后，小鼠成骨細胞增殖率顯著增加， 且與作用時間藥物濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。 人參是祖國醫(yī)學(xué)中的一味傳統(tǒng)中藥，具有“大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺，生津，安神”功效。 我科前期的研究發(fā)現(xiàn)：GSS 能夠增強地塞米松的臨床療效， 聯(lián)合地塞米松可以更好地防治TACE 術(shù)后綜合征[9]，還能夠顯著提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床治療效果，減少激素的用量[10]。在動物實驗中， 我科之前的研究也發(fā)現(xiàn)GSS 可通過改善骨代謝，拮抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失[3]。 結(jié)合我們的研究結(jié)果提示：促進成骨細胞增殖可能是GSS 發(fā)揮抗GIOP 作用的重要分子機制。

調(diào)控成骨細胞增殖的是一個復(fù)雜而又相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)，包含多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細胞因子。 細胞生長依靠細胞周期的運行，受細胞核內(nèi)的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控。 細胞周期調(diào)控蛋白分為正向周期調(diào)控蛋白和負向周期調(diào)控蛋白，分別促進/抑制細胞周期運行。 p21 和p27 均屬于細胞周期蛋白激酶抑制劑中Cip/Kip 家族成員， 發(fā)揮抑制細胞增殖的作用[11]。 在正常細胞中，p21 和p27 可以通過結(jié)合抑制Cyclin-CDKs 復(fù)合體的活性， 導(dǎo)致細胞周期阻滯在G1/S 期，從而抑制細胞增殖。 我們的研究發(fā)現(xiàn)，50、及25 μg/mL 的GSS 處理MC3T3-E1 細胞24 h 后，細胞周期抑制蛋白p21 及p27 表達水平較空白對照組顯著下降；而12.5 μg/mL 的GSS 處理MC3T3-E1細胞24 h 后，p21 及p27 蛋白及mRNA 表達水平較空白對照無明顯改變， 提示GSS 低濃度時可能對RNA 表達水平無明顯影響，但可能能夠在翻譯水平上影響p21 及p27 的表達，或促進p21 及p27 的降解。 Cyclin D1 是細胞周期的正調(diào)控因子，其通過使Rb 蛋白磷酸化，促使細胞由G1 期進入S 期，引起細胞增殖[12]。 我們的結(jié)果表明，GSS 能夠顯著上調(diào)Cyclin D1 表達水平， 進而促進細胞G1 期進入S期，進而促進細胞增殖。

本研究的結(jié)果顯示，GSS 能夠通過上調(diào)Cyclin D1 表達，抑制p21 和p27 表達，進而促進小鼠成骨細胞增殖，提示促進成骨細胞增殖可能是GSS 發(fā)揮抗GIOP 作用的分子機制之一。

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