曹貴陽 張 瑞 霍金海

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

紫菀為常用中藥，中國藥典（2010版）收載其來源為菊科植物紫菀（Aster tataricusL.f.）的干燥根莖及根，具潤(rùn)肺下氣、鎮(zhèn)咳祛痰之功效，主治氣逆咳嗽，痰吐不利、肺虛久咳、痰中帶血等癥，在中醫(yī)臨床處方及中成藥中用量很大。但目前紫菀評(píng)價(jià)還停留在單一成分含量測(cè)定，急需一種全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的技術(shù)方法。本文所建立指紋圖譜是以3種已知化合物為標(biāo)記峰，以14個(gè)共有峰作為特征峰的紫菀藥材指紋圖譜，其信息量多，方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，并所建立指紋譜與藥效密切相關(guān)，使所建立的方法更行之有效。

1 儀器與試藥

1.1 藥材采集

本研究收集了10個(gè)不同產(chǎn)地不同采收期的紫菀根及根莖藥材樣品（Aster tataricusL.f.）來源見表1-1（經(jīng)生藥學(xué)鑒定）。晾干，切成小段，置烘箱內(nèi)，于40℃烘干8 h，取出，用粉碎機(jī)粉碎，過3號(hào)篩，置干燥器中，備用。本品應(yīng)符合中國藥典中藥材標(biāo)準(zhǔn)2000年版紫菀項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器

1100型高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司 )，Shiseido C18色 譜 柱 (4.6mm×250mm，5μm)，Agelient C18色 譜柱 (4.6mm×250mm，5μm)， Diamonsil鉆 石 C18色 譜 柱（4.6mm×250mm，5μm）；KQ-300DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ATC2-5-U型超純水系統(tǒng)（重慶艾科浦公司）；BP211D型電子天平 （德國Sartorius公司）。

表1-1樣品產(chǎn)地

4 2012.秋 吉林 9 2009.秋 山西5 2009.秋 遼寧 10 2009 秋 甘肅

1.3 試藥

乙腈、甲醇為色譜純（美國迪馬公司）；冰乙酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為自制超純水；其余試劑均為分析純，（沈陽化學(xué)試劑廠）；

1.4 參照物

紫菀酮對(duì)照品（批號(hào)111581-200604）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-200406）、山奈酚（批號(hào)110861-200406）、紫菀對(duì)照藥材（批號(hào)0956-9903）槲皮素由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18色譜柱 （4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.02%磷酸溶液-乙腈；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：200nm；進(jìn)樣量：20 μl，梯度洗脫條件：0-10分鐘，90：10（水：乙腈）；10-15分鐘，78：12（水：乙腈）；15-30分鐘77：23（水：乙腈）；30-43分鐘，65：35（水：乙腈）；43-50分鐘，40：60（水：乙腈）；50-60分鐘，35：65（水：乙腈）。

2.2 供試品溶液的制備

取紫菀藥材(過20目篩)，精密稱取藥材2g，用100%甲醇超聲提取30min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品的制備

取紫菀酮、槲皮素、山奈酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成1mL中含1mg的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為6的紫苑藥材，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到共有色譜峰面積及保留時(shí)間。結(jié)果峰面積及保留時(shí)間RSD均小于3%，說明此方法的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為6的紫苑藥材，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定主要色譜峰面積。結(jié)果峰面積及保留時(shí)間RSD均小于5%，表明方法重復(fù)性符合要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為6的紫苑藥材，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0、4、8、16、24h，測(cè)定指紋圖譜，測(cè)定主要色譜峰面積。峰面積及保留時(shí)間RSD均小于3%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 紫菀指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的采集 精密稱取10批紫苑藥材粉末各2.0g，分別按照2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，依據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20μl，將各批次紫菀藥材的HPLC-UC指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版，設(shè)定匹配模板，生成對(duì)照指紋圖譜。結(jié)果見圖6-1。

圖6-1不同產(chǎn)地紫菀藥材指紋圖譜的比較

2.5.2 指紋圖譜共有峰的確定 用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版(國家藥典委員會(huì))比較不同產(chǎn)地樣品的色譜圖，其中有14個(gè)色譜峰是共有的，確定為共有峰(圖5-1)。校正后的保留時(shí)間分別為8.725、10.034、21.336、23.474、25.73、26.147、29.225、30.568、34.145、42.516、52.339、58.046、61.598、63.421min。

2.5.3 紫菀指紋圖譜相似度 按上述指紋圖譜條件，制備紫菀供試品溶液，進(jìn)樣20ul，計(jì)算10批不同產(chǎn)地紫菀樣品的相似度，計(jì)算結(jié)果見表6-1。

表6-1相似度軟件評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 小結(jié)

（1）采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，比較紫菀所有測(cè)定和記錄的色譜圖，我們分析了不同產(chǎn)地紫菀的HPLC指紋圖譜，目的在于更全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)紫菀的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，紫尤其是山東產(chǎn)地相似度最差。表明紫菀個(gè)別樣本之間相似性較差，說明不同的生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)對(duì)紫菀的質(zhì)量有一定的影響，仍然有一定產(chǎn)地藥材偏離整體水平較遠(yuǎn)，在選擇藥材產(chǎn)地時(shí)應(yīng)予以注意，縮小藥材的產(chǎn)地范圍，無疑對(duì)保證紫菀的質(zhì)量一致具重要作用。

（2）由于中藥成分復(fù)雜，在流動(dòng)相及梯度選擇上，用單一流動(dòng)難以實(shí)現(xiàn)各色譜峰的基線分離，而梯度洗脫可以使不同極性的各成分有效分離。實(shí)驗(yàn)表明，冰醋酸加入到流動(dòng)相中可以改善峰形，從而改善分離效果。通過大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，1%冰醋酸溶液-乙腈梯度洗脫分離效果良好，產(chǎn)生滿意的HPLC色譜圖，其它流動(dòng)相系統(tǒng)組合均不能使其成分得到很好的分離。