徐惠梅 崔 欣 海錦歌 路瑞華

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

病毒性心肌炎是由嗜心肌性病毒感染而發(fā)的局限性或彌漫性炎癥的心肌疾病。有研究表明其病程中的心室重構(gòu)不僅與心肌細(xì)胞壞死、凋亡和免疫損傷有關(guān)，而且與心肌間質(zhì)膠原纖維的改變密切相關(guān)。其中膠原降解系統(tǒng)MMPs的高表達(dá)與MMPs/TIMPs的比例失調(diào)在病毒性心肌炎心肌間質(zhì)重構(gòu)起著重要作用。[1]本研究旨在用中藥干預(yù)病毒性心肌炎動(dòng)物模型，在細(xì)胞水平觀察心樂膠囊對(duì)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 柯薩奇B3型(CVB3)，Nancy株，引自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性小鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，3周齡，體重20±2克。合格證號(hào)：SCXK(黑) 2008004。

1.1.3 主要試劑及藥品 一抗為Rabbit Anti-TIMP-1、Rabbit Anti-MMP-1北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。二抗為兔二步法檢測(cè)試劑盒PV-6001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。心樂膠囊：黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室提供；玉丹榮心丸：上海玉丹藥物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備、分組及給藥將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間體重?zé)o顯著性差異：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、玉丹榮心丸組、心樂膠囊低、中、高劑量組。除空白組外，后5組小鼠給予500 TCID50 CVB3稀釋液0.2ml腹腔注射，每四天注射一次，連續(xù)注射四次，建立病毒性心肌炎小鼠模型。注射結(jié)束后玉丹榮心丸組按3.51g/kg給予玉丹榮心丸混懸液0.2ml，灌胃日一次；心樂膠囊高、中、低個(gè)劑量組分別給予按2.184g/kg、1.092g/kg、0.546g/kg的混懸液0.2ml灌胃日一次；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃日一次， 療程15天。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 斷頸處死小鼠，取心臟，用4%多聚甲醛液固定后石蠟包埋、切片、DAB顯色，如有需要蘇木素復(fù)染。根據(jù)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司試劑說明書中抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，MMP-1、TIMP-1均為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

采用APSAP法測(cè)定MMP-1、TIMP-1平均陽(yáng)性染色面積百分比[2]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x-±s)表示。總體數(shù)據(jù)用One-Way ANOVA作統(tǒng)計(jì)分析，用LSD檢驗(yàn)作各組間均數(shù)兩兩比較。檢驗(yàn)顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

除空白組外，其余各組小鼠于感染后2～3天發(fā)病，出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食減少、聳毛。造模期間各組均有1只小鼠死亡。灌胃治療開始后，模型組死亡2只，玉丹榮心丸組較心樂膠囊各劑量組小鼠易激惹。其余小鼠癥狀逐漸減輕，活動(dòng)較前好轉(zhuǎn)，其中治療組均較模型組癥狀輕。空白組無發(fā)病及死亡。

2.2 各組心肌組織MMP-1蛋白水平比較

表1 各組心肌組織MMP-1蛋白水平比較

▽▽P ＜0.05；與玉丹榮心丸組比較◆P＜0.01，◆◆P ＜0.05；與心樂膠囊中低劑量組比較▲P＜0.01。

2.3 各組心肌組織TIMP-1蛋白水平比較

表2 各組心肌組織TIMP-1蛋白水平比較

3 討論

在正常心肌細(xì)胞中，MMPs的正常表達(dá)與MMPs/TIMPs比例平衡起著非常重要的作用。MMPs 是內(nèi)源性蛋白水解酶家族，是細(xì)胞外基質(zhì)的破壞與降解過程中重要作用的生理調(diào)節(jié)因子。組織金屬蛋白酶抑制因子( TIMP) 是MMPs的特異性抑制物。TIMP與MMP以1：1的比例形成MMP- TIMP復(fù)合體，從而阻斷MMP與底物結(jié)合，抑制MMP的活性，降低膠原的降解。

在整個(gè)病毒性心肌炎的病程中，心肌膠原的改變是由修復(fù)性纖維化到反應(yīng)性纖維化的動(dòng)態(tài)演變過程，急性期是修復(fù)性纖維化以Ⅰ型膠原增生為主，恢復(fù)期修復(fù)性纖維化與反應(yīng)性纖維化并存，發(fā)展至慢性期的反應(yīng)性纖維化以Ⅲ型膠原增生為主。[3]本實(shí)驗(yàn)研究的MMP-1的主要功能則為降解Ⅰ、Ⅲ型膠原，其在病毒性心肌炎整個(gè)病程中持續(xù)高表達(dá)直至恢復(fù)期。TIMP-1作為其特異性抑制因子，可阻斷其與底物結(jié)合，從而抑制膠原的溶解， 延緩心室重構(gòu)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的MMP-1水平明顯升高（P＜0.01），TIMP-1水平明顯下降（P＜0.01）。提示MMP-1活性升高，TIMP-1活性降低，兩者平衡失調(diào)，膠原降解增加，促使心肌纖維化的發(fā)生。與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組MMP-1水平下降（P＜0.05），而心樂膠囊各劑量組MMP-1水平下降明顯（P＜0.01），與低劑量組相比，心樂膠囊高劑量組MMP-1水平下降更明顯（P＜0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性藥對(duì)照組TIMP-1水平升高（P＜0.05），而心樂膠囊各劑量組TIMP-1水平升高明顯（P＜0.01），與低劑量組相比，心樂膠囊高劑量組TIMP-1水平升高更明顯（P＜0.05）。以上結(jié)果提示玉丹榮心丸與心樂膠囊均能使MMP-1水平降低，促進(jìn)TIMP-1水平升高，減小MMP-1/TIMP-1的比值，從而減少心肌膠原蛋白過度降解，延緩心肌纖維化進(jìn)程。與低劑量組比，心樂膠囊高劑量組效果更為明顯，表明心樂膠囊的抗心肌纖維化作用可能與劑量呈正相關(guān)作用。

[1] 韓奇杰，等. 病毒性心肌炎引起心肌纖維化機(jī)制探討[J].國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36：512-515.

[2] 姜洋，金小明，屠康. 平均陽(yáng)性染色面積百分比法分析免疫組化結(jié)果初探[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2007；24（3）：650-653.

[3] 王娟，程志青.基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化[J].中國(guó)心血管雜志，2007；12：467-469.