劉國(guó)軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

線(xiàn)栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實(shí)踐探討

劉國(guó)軍，溫世斌

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

目的 觀察不同線(xiàn)栓頭端處理方法及不同插線(xiàn)深度對(duì)線(xiàn)栓法制作成年Wistar大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷再灌注模型（MCAO/R）造模效果及大鼠存活率的影響。方法 依據(jù)改良Longa線(xiàn)栓法制作MCAO/R模型，插入不同深度尼龍線(xiàn)制作模型。于24小時(shí)、48小時(shí)后測(cè)定神經(jīng)功能缺損評(píng)分并觀察各組大鼠存活率。比較線(xiàn)栓頭端蘸蠟處理法和熏香燒灼處理頭端法制作MCAO/R模型48小時(shí)存活率及神經(jīng)功能缺損評(píng)分。結(jié)果 第二組、第三組、第四組大鼠24小時(shí)和48小時(shí)的存活率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分與第一組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中大鼠存活率第一組最高，第四組最低；神經(jīng)功能缺損評(píng)分第一組最低，第四組最高。兩種線(xiàn)栓頭端處理方法在相同插線(xiàn)深度（1.8 cm、2.0 cm、2.2 cm）的存活率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 蘸蠟法與熏香燒灼法處理線(xiàn)栓頭端對(duì)造模成功率無(wú)明顯影響。線(xiàn)栓插入越深，神經(jīng)功能缺損評(píng)分越高，存活率越低。線(xiàn)栓插入深度2.0 cm更適用于建立大鼠MCAO/R模型。

線(xiàn)栓法；大鼠；局灶性腦缺血再灌注模型

線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型（MCAO/R）被普遍認(rèn)為是腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，特別適合于局部腦損傷后神經(jīng)功能改變及治療藥物評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究［1-2］。不同線(xiàn)栓頭端處理方法及不同插線(xiàn)深度對(duì)線(xiàn)栓法制作MCAO/R模型影響的相關(guān)研究較少，因此，本研究觀察不同線(xiàn)栓頭端處理方法及插線(xiàn)深度對(duì)線(xiàn)栓法制作MCAO/R模型造模效果及大鼠存活率的影響，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

SPF級(jí)成年Wistar大鼠56只，體質(zhì)量（300±20）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。直徑0.26 mm尼龍線(xiàn)。

1.2 MCAO/R模型制作

1.2.1 分組 大鼠適應(yīng)環(huán)境7天后隨機(jī)分成7組，每組8只。第一、二、三組均設(shè)模型組及對(duì)照組，這6個(gè)組線(xiàn)栓插入深度分別為1.8 cm，1.8 cm；2.0 cm，2.0 cm；2.2 cm，2.2 cm。第四組線(xiàn)栓插入深度至最大，直至遇到較大阻力且大鼠出現(xiàn)深呼吸為止（約2.4～2.5 cm）。

1.2.2 模型制作 第一、二、三組中的模型組采用熏香燒灼頭端，第一、二、三組中的對(duì)照組采用蘸蠟法處理線(xiàn)栓頭端。（1）線(xiàn)栓及線(xiàn)栓頭端的處理。將直徑0.26 mm的尼龍線(xiàn)剪成5 cm長(zhǎng)的小段，60℃～70℃加熱2小時(shí)制作成外切角約為30°左右的弧形，頭端用熏香快速燒灼，使一端熔化成球形，然后打磨并用75%的酒精浸泡處理備用。另選尼龍線(xiàn)小段，將頭端蘸蠟后倒垂，待頭端凝固成球形，保持頭端直徑均為0.30 mm且包被多聚賴(lài)氨酸。

（2）插入深度依據(jù)及線(xiàn)栓標(biāo)記。依據(jù)崔龍等“同身寸”法估算大鼠局灶性腦缺血模型線(xiàn)栓深度。用血管鉗夾標(biāo)記等長(zhǎng)度對(duì)比（血管鉗內(nèi)面作為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)）以及使用0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、3.0 mm粗細(xì)不同的記號(hào)筆標(biāo)記預(yù)插線(xiàn)栓深度，并分組比較其印記標(biāo)記及同組誤差。

（3）模型制作過(guò)程。采用改良Longa線(xiàn)栓法［3］，以10%水合氯醛麻醉，術(shù)區(qū)常規(guī)剃毛消毒，頸部右側(cè)旁正中切開(kāi)，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），并于CCA掛手術(shù)線(xiàn)備用。在頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）掛線(xiàn)。分離暴露ECA主干，在其根部打結(jié)。小動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端，夾閉ICA。在CCA近頭端距分叉部5 mm處斜行剪一小口，導(dǎo)入線(xiàn)栓進(jìn)入ICA。移開(kāi)夾在ICA的小動(dòng)脈夾，將線(xiàn)栓插入至設(shè)計(jì)深度，遇阻力停止。結(jié)扎切口處CCA掛線(xiàn)，去除CCA的血管夾。確認(rèn)無(wú)出血后縫合皮膚，皮膚外留線(xiàn)頭約0.5 cm，術(shù)后2小時(shí)抽出線(xiàn)栓形成再灌注。

1.3 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 建模成功表現(xiàn)：左前肢持續(xù)屈曲，提尾實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。側(cè)推抵抗力減弱，轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，1～4分為造模成功。0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀，活動(dòng)正常；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識(shí)喪失；5分：死亡［4-6］。期間注意觀察大鼠呼吸及心率變化。

1.3.2 存活率 術(shù)后24小時(shí)及48小時(shí)統(tǒng)計(jì)動(dòng)物存活數(shù)，計(jì)算存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠24小時(shí)、48小時(shí)存活率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠24小時(shí)、48小時(shí)存活率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，分）

表1 各組大鼠24小時(shí)、48小時(shí)存活率和神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，分）

注：與第一組比較，＊P＜0.05

組別第一組第二組第三組第四組插線(xiàn)深度（cm）1.8 2.0 2.2 2.5存活率（%）24小時(shí)48小時(shí)100.0 87.5 62.5 37.5＊＊＊100.0 75.0 50.0 25.0＊ ＊＊神經(jīng)功能缺損評(píng)分1.0±0.0 1.9±0.7＊2.8±0.8＊3.6±0.6＊

第二、三、四組大鼠24小時(shí)和48小時(shí)存活率與第一組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第一組最高，第四組最低；不同組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中第一組最低，第四組最高。

2.2 不同線(xiàn)栓頭端處理方法對(duì)模型的影響（見(jiàn)表2）

表2 不同線(xiàn)栓頭端處理方法對(duì)模型的影響（±s，分）

表2 不同線(xiàn)栓頭端處理方法對(duì)模型的影響（±s，分）

組別第一組第二組第三組插線(xiàn)深度1.8 cm 2.0 cm 2.2 cm P模型組對(duì)照組模型組對(duì)照組模型組對(duì)照組48小時(shí)存活率（%）100.0 100.0 75.0 75.0 50.0 50.0神經(jīng)功能缺損評(píng)分1.0±0.0 1.0±0.2 2.0±0.5 2.2±0.6 2.8±0.8 2.7±0.6＞0.05＞0.05＞0.05

將熏香燒灼頭端的設(shè)為模型組，將蘸蠟法處理頭端的設(shè)為對(duì)照組。頭端大小均勻一致且均需經(jīng)過(guò)多聚賴(lài)氨酸處理。

2.3 不同粗細(xì)記號(hào)筆尖與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（見(jiàn)表3）

表3 不同粗細(xì)記號(hào)筆尖標(biāo)記印記與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（±s，mm）

表3 不同粗細(xì)記號(hào)筆尖標(biāo)記印記與血管鉗夾標(biāo)記印記的區(qū)別（±s，mm）

同組誤差（mm）記號(hào)筆標(biāo)記血管鉗夾標(biāo)記筆尖粗細(xì)（mm）0.5 1.0 1.5 3.0 -印記寬度0.5±0.10 1.0±0.15 1.5±0.20 3.0±0.30 -＜0.1 0.1±0.0 0.2±0.1 0.3±0.1 0.0

不同粗細(xì)筆尖標(biāo)記印記組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5～1.0 mm印記細(xì)，需要仔細(xì)辨認(rèn)，3.0 mm印記易擴(kuò)大，同組誤差大而使插入深度無(wú)法精確。調(diào)查顯示，血管鉗夾標(biāo)記與不同粗細(xì)記號(hào)筆尖標(biāo)記誤差比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

線(xiàn)栓法制作MCAO/R模型因易于操作且損傷小、可重復(fù)性高而應(yīng)用廣泛［7］。但是線(xiàn)栓直徑、線(xiàn)栓頭端直徑及頭端有無(wú)包被多聚賴(lài)氨酸、術(shù)中出血量、線(xiàn)栓留置時(shí)間、線(xiàn)栓插入深度及血管解剖等因素均可影響MCAO/R模型制作的成功率和可重復(fù)性［8-9］。

（1）線(xiàn)栓的制備至關(guān)重要，包括匹配體重大鼠線(xiàn)栓直徑的選擇、線(xiàn)栓頭端的科學(xué)處理及其弧度和插入線(xiàn)栓深度的精確標(biāo)記。線(xiàn)栓加熱制作成外切角約為30°左右的弧形，可確保線(xiàn)栓弧度與大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈走行一致，插入線(xiàn)栓時(shí)更容易調(diào)整角度和方向使其準(zhǔn)確進(jìn)入ICA。本研究表明，只要操作準(zhǔn)確，線(xiàn)栓頭端蘸蠟法與頭端熏香燒灼法處理對(duì)造模效果影響不大。具體插線(xiàn)直徑的選擇應(yīng)根據(jù)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。研究證明，體質(zhì)量為（280±20）g的大鼠更適合造模。

（2）插線(xiàn)深度對(duì)造模結(jié)果的影響：本研究表明，隨著線(xiàn)栓插入深度增加，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分增高，說(shuō)明腦梗死體積不斷增大，但是大鼠存活率明顯降低。當(dāng)線(xiàn)栓插入深度最深（2.4～2.5 cm）時(shí)，死亡率過(guò)大而影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，死亡原因可能是腦梗死面積過(guò)大而癥狀過(guò)重，或?qū)е轮刖W(wǎng)膜下腔出血，或線(xiàn)栓穿破血管致腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血而加重腦卒中癥狀。當(dāng)線(xiàn)栓插入深度為2.0 cm時(shí)，神經(jīng)功能缺損評(píng)分適合且術(shù)后存活率較高，術(shù)后48小時(shí)大鼠存活率可達(dá)75.0%。因此，建議建立（280±20）g實(shí)驗(yàn)性Wistar大鼠MCAO/R模型的插入線(xiàn)栓深度為2.0 cm。

（3）插線(xiàn)深度的準(zhǔn)確標(biāo)記：目前報(bào)道MCAO/R模型制備的線(xiàn)栓多采用記號(hào)筆標(biāo)記尼龍線(xiàn)刻度，筆者經(jīng)過(guò)多次反復(fù)實(shí)踐認(rèn)為該方法存在缺陷，即記號(hào)筆細(xì)則容易模糊標(biāo)記點(diǎn)，而記號(hào)筆粗則容易使標(biāo)記印過(guò)大甚至超過(guò)0.3 cm，以致誤差較大，插入深度無(wú)法精確。血管鉗夾標(biāo)記誤差幾乎為0，因此，應(yīng)將線(xiàn)栓統(tǒng)一剪成5 cm小段并用小的血管鉗夾在預(yù)插線(xiàn)深度，通過(guò)比較插線(xiàn)長(zhǎng)度的方法來(lái)判斷插入的深度，既可保證插入深度精確，又可節(jié)省線(xiàn)栓處理時(shí)間。

綜上所述，正確處理線(xiàn)栓和選擇插入線(xiàn)栓的合適深度是保證線(xiàn)栓法制備大鼠MCAO/R模型成功的關(guān)鍵。血管鉗夾標(biāo)記插線(xiàn)深度的誤差小，節(jié)省了操作時(shí)間，并使插線(xiàn)的插入深度更加精準(zhǔn)。

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1671-1246（2015）14-0075-02