呂春榮，權(quán)國波，吳國權(quán)，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞凋亡研究

呂春榮，權(quán)國波，吳國權(quán)，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

采用2種不同方法檢測云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）凋亡情況，為后續(xù)的誘導(dǎo)分化研究奠定基礎(chǔ)。利用凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒和AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HFSCs凋亡。結(jié)果：凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測表明，第2代細(xì)胞凋亡率6.0%，第6代細(xì)胞凋亡率6.5%；AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測表明，第2代細(xì)胞凋亡率0.24%，第6代細(xì)胞凋亡率0.80%。說明云南半細(xì)毛羊HFSCs細(xì)胞生長狀態(tài)很好。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞凋亡率有所上升。

云南半細(xì)毛羊；HFSCs；細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡，即細(xì)胞程序性死亡［1］。它與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。細(xì)胞凋亡貫穿于機(jī)體的整個生命周期，完成新舊細(xì)胞的生死交替，它對機(jī)體的發(fā)育存活及維持正常生理功能都有著重要意義。另外，細(xì)胞凋亡還參與某些疾病的發(fā)生、清除損傷、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、防止癌變等過程。因此，研究細(xì)胞凋亡及其機(jī)理具有重要的理論及實(shí)踐意義。

使用碘化丙啶（PI）染色檢測DNA含量是最早出現(xiàn)的凋亡定量檢測方法［2］。進(jìn)入90年代，檢測DNA斷裂點(diǎn)的TUNEL（terminal deoxylnucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling）技術(shù)成為凋亡定量檢測的主流。1995年Vermes首次使用熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（FITC-Annexin V）聯(lián)合PI染色雙參數(shù)技術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡［3］。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

來自于云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草食家畜研究所2012年冷凍保存的云南半細(xì)毛羊HFSCs 8支。

1.2 方法

1.2.1 凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒操作步驟

1.2.1.1 細(xì)胞樣本的準(zhǔn)備 A.自然晾干的細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片或爬片），4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min。B.在封閉液中室溫封閉10 min，PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min。C.在通透液中，冰上（2～8℃）促滲2 min。

1.2.1.2 陽性對照及陰性對照的準(zhǔn)備 A.陽性對照樣本的準(zhǔn)備：細(xì)胞樣本在TritonX-100通透液處理、PBS清洗后，再加入100 μL DNaseI反應(yīng)液，室溫37℃處理10～30 min，其余步驟均相同。B.陰性對照樣本的準(zhǔn)備：在標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。

1.2.1.3 標(biāo)記和顯色反應(yīng) A.預(yù)處理好的樣本PBS漂洗2次，樣本周圍用吸水紙吸干。B.每個樣本滴加50 mL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60 min，PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min，樣本周圍用吸水紙吸干。C.滴加50 mLStreptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60 min，PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min。D.滴加50～100 μLDAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min，PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min。

1.2.1.4 蘇木素復(fù)染 蘇木素復(fù)染后，漂洗脫水、觀察。

1.2.2 AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HFSCs凋亡操作步驟 A.將單細(xì)胞懸液加入2 mL圓底離心管中離心，1 500 r/min，5 min，棄上清液。B.加入PBS1 mL離心洗滌2次，棄上清。C.加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞。D.加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，加入5 μLPropidium Iodide，陽性對照組分別加入FITC和PI。E.室溫避光孵育5～310 min。F.在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測結(jié)果

在顯微鏡下，隨機(jī)觀察統(tǒng)計3個視野，每個視野100～200個細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率：

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（如圖1所示），圖1B中白色箭頭所示為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕褐色的Tunel陽性細(xì)胞；通過與細(xì)胞凋亡的陽性對照與陰性對照比較可得出：云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞凋亡的細(xì)胞很少，通過計算，第2代細(xì)胞凋亡率6.0%，第6代細(xì)胞凋亡率6.5%。

圖1 第6代HFSCs凋亡檢測（100×）（白色箭頭示陽性細(xì)胞，黑色箭頭示陰性細(xì)胞）

2.2 AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HFSCs凋亡檢測結(jié)果

分別收集第2代、第6代云南半細(xì)毛羊HFSCs，用AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HFSCs凋亡結(jié)果，進(jìn)行凋亡分析。第2代細(xì)胞凋亡率0.24%，第6代細(xì)胞凋亡率0.80%，說明隨著培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞凋亡率有所上升。見圖2。結(jié)果判定：I象限（EGFP-/PI-）為正常細(xì)胞；II象限（EGFP-/PI+）為細(xì)胞處理過程中機(jī)械性損傷造成壞死的細(xì)胞；III象限（EGFP+/PI+）為晚期凋亡細(xì)胞及部分壞死細(xì)胞；IV象限（EGFP+/PI-）為早期凋亡細(xì)胞。

圖2 HFSCs流式分析

3 討論

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)對細(xì)胞凋亡檢測的影響

細(xì)胞生長匯合至瓶底80%～90%時需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。把握傳代的時機(jī)與再培養(yǎng)的密度對于大多數(shù)生命力較為脆弱的體外培養(yǎng)細(xì)胞至關(guān)重要。傳代過早，細(xì)胞接種密度低，相互間在形態(tài)和機(jī)能上的依存關(guān)系減弱，使細(xì)胞不易培養(yǎng)；傳代過晚，由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)消耗過盡、代謝產(chǎn)物積累、pH值降低而引起細(xì)胞中毒；以及細(xì)胞間接觸抑制和細(xì)胞形態(tài)改變等，嚴(yán)重時細(xì)胞匯合成片從培養(yǎng)底壁脫落死亡。云南半細(xì)毛羊HFSCs在培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至80%時，將培養(yǎng)液棄去，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）在37℃消化5～8 min后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞開始變圓時，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1∶2的比例進(jìn)行傳代。通過凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測結(jié)果表明，云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞凋亡的細(xì)胞很少，通過計算，第2代細(xì)胞凋亡率6.0%；第6代細(xì)胞凋亡率6.5%。AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，第2代細(xì)胞凋亡率0.24%，第6代細(xì)胞凋亡率0.80%。通過2種不同凋亡檢測方法研究發(fā)現(xiàn)：隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞凋亡率均有所上升。

3.2 不同方法對細(xì)胞凋亡的影響

目前國內(nèi)外最為常用的凋亡定量檢測方法是檢測DNA斷裂點(diǎn)的TUNEL法。在TDT作用下將FITC-dUTP摻入DNA裂點(diǎn)的3′-OH端上，根據(jù)其摻入量的多少計算凋亡細(xì)胞百分比。由于DNA斷裂發(fā)生在凋亡早期，因此該法可檢出早期凋亡細(xì)胞，具有較高靈敏性。但該法最大缺點(diǎn)是壞死細(xì)胞亦呈現(xiàn)TUNEL反應(yīng)陽性，使其特異性降低［4］。本研究也證實(shí)了這點(diǎn)，凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測云南半細(xì)毛羊HFSCs凋亡，通過計算，第2代細(xì)胞凋亡率6.0%，第6代細(xì)胞凋亡率6.5%。明顯高于AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

凋亡定量檢測常需借助流式細(xì)胞檢查。流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry）以其方便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的檢測［5］。最早出現(xiàn)且較為常用的流式細(xì)胞凋亡定量檢測技術(shù)是PI染色法。但該法操作麻煩，并存有高漏檢率等，現(xiàn)在很少有人使用。1992年Fadok等［6］報道在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸（PS）遷移至細(xì)胞外側(cè)。由于壞死細(xì)胞PS亦暴露于外表使Annexin V結(jié)合陽性，因此必須同時采用PI這一壞死細(xì)胞染色陽性的DNA染料將壞死細(xì)胞區(qū)分出來。1995年Vermes等［3］首次使用熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（FITC-Annexin V）聯(lián)合PI染色雙參數(shù)技術(shù)定量檢測凋亡。與PI法檢測凋亡不同的是該法不需要固定細(xì)胞，因此凋亡細(xì)胞PI低染。國內(nèi)學(xué)者鄭俊年等［7］使用PI染色、Annexin V PI、TUNEL 3種方法凋亡檢出率分別為27.19%、32.28%、50.17%，兩兩之間均有顯著差異（P<0.01）。本研究中凱基TUNEL-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒檢測云南半細(xì)毛羊HFSCs凋亡，通過計算，第2代細(xì)胞凋亡率6.0%，第6代細(xì)胞凋亡率6.5%。明顯高于AnnexinV-EGFP/PI標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（第2代細(xì)胞凋亡率0.24%，第6代細(xì)胞凋亡率0.80%）。

除以上方法外，還有不常用的方法。4，6－聯(lián)脒－2苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenyiindole，DAPI）是DNA特異性的熒光染料，與DNA結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)，使用時無需用RNaseA處理細(xì)胞，但由于配置紫外激光源的流式細(xì)胞儀非常昂貴，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有配備。因此，以DAPI標(biāo)記DNA分析細(xì)胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測方法被普遍采納，也沒有簡單的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程可供參考［8］。

近年來有關(guān)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控等方面的研究已取得重大進(jìn)展，但作為所有研究基礎(chǔ)的凋亡定量檢測技術(shù)卻進(jìn)展不大。選用何種凋亡檢測技術(shù)已成為研究的關(guān)鍵。

［1］ Majno，Joris G J.Apoptosis，oncosis and necrosis，An overview of cell death［J］.AmJ Pathol，1995，146：3-16.

［2］ Nicoletti I，Migliorati G，Pagliacci M C.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry［J］.J Immunol Methods，1991，139：271.

［3］ Vermes I，Haanen C，Steffens-Nakken H，et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometry detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis cells using fluorescein labeled Annexin V［J］.J Im munol Methods，1995；184：39.

［4］ Gorczyca W，Gong J P，Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxymucleotidyl transferase and nick translation assay［J］.Cancer Res，1993，53：19-45.

［5］ Lacombe F，Belloc F.Flowcytometrystudyofcell cycle，apoptosis and drugresistance in acute leukemia［J］.Hematol Cell Ther，1996，38（6）：495.

［6］ FadokV A，Voelker D R，Campbell P A，et al.Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophage［J］.J Immuol，1992，148：2207.

［7］ 鄭駿年，謝叔良，陳家存，等.流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡3種方法的比較研究［J］.免疫學(xué)技術(shù)與方法，1999，10（15）：467-469.

［8］ 劉錫娟，丁慧榮，張宏.用DAPI和Hoechst33342染色法檢測DNA的流式細(xì)胞方法探討［J］.北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，42（4）：480-484.

Study on Apoptosis of Hair Follicle Stem Cells in Yunnan Semi-fine Wool Sheep

LvChunrong，Quan Guobo，HongQionghua，et al
（Yunnan Institute ofAnimal Science and Veterinary,Kunming 650224,China）

The apoptosis ofhair follicle stem cells（HFSCs）in Yunnan semi-fine wool sheep were detected by two different methods in order tocarryout the subsequent research about induction and differentiation ofHFSCs.The TUNEL-Cell Apoptosis in situ Detection Kit was used todetect apoptosis ofHFSCs.The combination of the AnnexinV-EGFP/PI staining and flowcytometry was used toobserve earlyapotosis occurringin HFSCs.The results fromthe TUNEL-Cell Apoptosis in situ Detection Kit indicated that the frequency of the apoptotic cells in the second generation was 6.0%.The frequency of the apoptotic cells in the sixthgeneration was 6.5%.The data from AnnexinV-EGFP/PI staining showed that the apoptotic rate of the HFSCs in the second gerenation was 0.24%；the apoptotic rate of the HFSCs in the sixth generation was 0.80%.It was concluded that the growth state of HFSCs in Yunnan semi-fine wool sheep was excellent.However,the frequency of apoptotic cells in HFSCs showed a steady increase with prolongingofthe passage numbers.

Yunnan semi-fine wool sheep;hair follicle stemcell;apoptosis

S826

A

2095-3887（2015）06-0006-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.002

2015-10-17

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2012FD083）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。