馬騰宇，陳麗麗，汪 志，白娜仁吐雅

（1. 天津食品集團(tuán)有限公司，天津 300074；2. 天津市奶牛發(fā)展中心，天津 300384；3. 天津嘉立荷畜牧有限公司，天津 300402）

·研究論文·

天津市奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

馬騰宇1，陳麗麗2，汪 志3，白娜仁吐雅3

（1. 天津食品集團(tuán)有限公司，天津 300074；2. 天津市奶牛發(fā)展中心，天津 300384；3. 天津嘉立荷畜牧有限公司，天津 300402）

通過(guò)血平板培養(yǎng)特性、革蘭氏染色、生化鑒定試驗(yàn)對(duì)天津市由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性分析。結(jié)果顯示，采集199份奶樣中共檢出葡萄球菌53株，其中金黃色葡萄球菌40株、表皮葡萄球菌13株；檢出的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。因此，可以采用以上4種抗生素對(duì)由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎進(jìn)行治療。

奶牛；乳房炎；葡萄球菌；藥敏試驗(yàn)

奶牛乳房炎與子宮炎、蹄病為奶牛三大難治愈的疾病，是奶牛的一種常見(jiàn)疾病與多發(fā)病。乳房炎是乳腺受到病原體的侵襲及物理、化學(xué)、微生物刺激所發(fā)生的一種炎癥變化，是奶牛的一種多發(fā)病，也是給奶牛業(yè)造成損失最大的疾病之一［1］。奶牛乳房炎由多種病原微生物引起，包括細(xì)菌、霉形體、真菌和病毒等，一般以細(xì)菌感染為主，其中葡萄球菌是牛乳房炎的最主要病原菌，鏈球菌和大腸桿菌也比較常見(jiàn)［2-4］。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因奶?；既榉垦讓?dǎo)致的產(chǎn)奶量下降可達(dá)380萬(wàn)噸［5］。因此對(duì)奶牛乳房炎采取適當(dāng)治療和對(duì)癥用藥，減少產(chǎn)奶量損失，對(duì)國(guó)際奶業(yè)的發(fā)展具有重要意義。奶牛乳房炎一般采用抗生素治療，殺滅侵入組織的致病菌，并消除炎癥反應(yīng)。常用抗菌藥物有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、磺胺類(lèi)及喹諾酮類(lèi)藥等［6］。本研究對(duì)天津市引起奶牛乳房炎的葡萄球菌進(jìn)行分離、鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥，有效降低乳房炎的發(fā)病率，促進(jìn)奶牛業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 奶樣采集 在天津市的大港區(qū)（位于天津的南部）、靜海區(qū)（位于天津的西部）、寶坻區(qū)（位于天津的北部）不同規(guī)模奶牛場(chǎng)選取患乳房炎病牛，其中在大港區(qū)3個(gè)牛場(chǎng)中選取20頭，靜海區(qū)2個(gè)牛場(chǎng)中選取10頭，寶坻區(qū)4個(gè)牛場(chǎng)中選取20頭。9個(gè)牛場(chǎng)采集199份奶樣，其中大港區(qū)80份奶樣、靜海區(qū)38份奶樣、寶坻區(qū)81份奶樣。奶樣品的采集：先用溫水清洗乳房，擦干后用浸有消毒藥液（如0.2%新潔爾滅溶液）的濕毛巾擦拭乳房，待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周?chē)Ｇ逑聪竞?，每個(gè)乳頭擠出3把奶棄掉，以排除一些污染的雜菌，然后以無(wú)菌操作的方法，每個(gè)乳室分開(kāi)，1個(gè)乳室現(xiàn)擠5～10 mL乳汁裝入滅菌試管或無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)，封好蓋，標(biāo)上牛號(hào)、乳室、日期等，保存于放有冰塊的保溫箱中，24 h內(nèi)檢驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 血瓊脂平板：對(duì)天津嘉立荷畜牧業(yè)有限公司提供的綿羊進(jìn)行頸部靜脈采血，無(wú)菌分離血液中的纖維蛋白，再以5%的比例溶于50℃～60℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，冷卻后置4℃冰箱備用，用于分離培養(yǎng)葡萄球菌。卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基：內(nèi)含7.5%NaCl（抑制葡萄球菌以外的其它菌生長(zhǎng)），用于選擇分離葡萄球菌。營(yíng)養(yǎng)肉湯用于增菌培養(yǎng)。丁胺卡那霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、慶大霉素、氟哌酸、鏈霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、克林霉素、復(fù)方新諾明12種新藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采取的乳樣置于無(wú)菌離心管中，442～1008×g離心10 min，棄去上層液體，無(wú)菌吸取底部沉淀物1 mL，加入含5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的玻璃管中，置于搖床上，進(jìn)行增菌培養(yǎng)24 h。然后挑菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)，37℃培養(yǎng)12～24 h后，挑取典型單個(gè)菌落接種到綿羊鮮血瓊脂平板上再次培養(yǎng)12～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行革蘭氏染色，配合顯微鏡檢查，觀察細(xì)菌形態(tài)、革蘭氏染色特點(diǎn)，挑選出單個(gè)菌落接種到卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌生化鑒定 純化培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵、甘露醇以及七葉苷水解試驗(yàn)，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［7］進(jìn)行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 在良好的光線(xiàn)下，以有黑字的白紙為背景，將培養(yǎng)液（菌懸液）與硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比濁，調(diào)整渾濁度至硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管相同濃度，如細(xì)菌濃度過(guò)高，用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液。將溶化好的M-H瓊脂傾注直徑90 mm的平皿，制成厚3～4 mm的M-H瓊脂平板。用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液，在管內(nèi)壁將多余菌液擠去，在瓊脂平板表面涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周，使菌液均勻涂滿(mǎn)整個(gè)瓊脂平板表面，蓋好平皿，室溫下干燥5 mim，待平板表面稍干即可放置藥敏片。用滅菌鑷子以無(wú)菌操作，夾住藥敏片邊緣取出，緊貼在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面。貼藥敏片時(shí)要輕輕按壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸。將平皿置于35℃～37℃溫箱中培養(yǎng)12～24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 葡萄球菌的分離與鑒定 葡萄球菌在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中迅速生長(zhǎng)，一致渾濁，渾濁率高，管底部有沉淀。在血平板上生長(zhǎng)良好，呈圓形或橢圓形，多成簇，也有成對(duì)和單個(gè)者，菌落直徑約1.5～2 mm，有的菌落呈米黃或金黃色，有的菌落呈乳白或灰白色，均不透明，表面光滑，邊緣整齊（圖1）。在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期基本與血液瓊脂平板相同，3 d后，葡萄球菌呈圓形、黃玉米色、邊緣整齊的小菌落，如圖2。純化后的細(xì)菌革蘭氏染色后鏡檢顯陽(yáng)性，呈圓形，以單個(gè)或短鏈狀、葡萄串狀排列（圖3）。性，七葉苷水解試驗(yàn)陰性判斷為金黃色葡萄球菌。觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，γ溶血，凝固酶陰性，麥芽糖陰性，甘露醇陰性，七葉苷水解試驗(yàn)陰性判斷為表皮葡萄球菌。

表1 葡萄球菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identifi cation of Staphylococcus

圖1 葡萄球菌在血瓊脂平板上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Staphylococcus on blood agar

圖2 葡萄球菌在卻甫曼瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征Fig .2 Colony characteristics of Staphylococcus on But FuMan medium

圖3 葡萄球菌純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色陽(yáng)性Fig3 Gram stain result of Staphylococcus

2.2 葡萄球菌和生化鑒定 如表1所示，觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，β溶血，凝固酶陽(yáng)性，麥芽糖陽(yáng)性，甘露醇陽(yáng)

2.3 天津市葡萄球菌檢出率 天津市3個(gè)區(qū)9個(gè)奶牛場(chǎng)199份奶樣中共檢出葡萄球菌53株，其中金黃色葡萄球菌40株，表皮葡萄球菌13株，見(jiàn)表2。

表2 奶樣中葡萄球菌檢出率Table 2 Positive rate of Staphylococcus in milk samples

2.4 藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離鑒定出的2種葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從表3可以看出，頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素、氟哌酸、四環(huán)素對(duì)葡萄球菌均有高抑制性；氨卞西林、慶大霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明對(duì)葡萄球菌有抑制作用；青霉素、鏈霉素以及紅霉素對(duì)葡萄球菌基本耐藥。

3 討論

馬保臣等［8］報(bào)道泌乳期臨床型乳腺炎病原菌以凝固酶陰性葡萄球菌為主。周慶國(guó)等［9］報(bào)道佛山地區(qū)4個(gè)奶牛場(chǎng)中的奶牛臨床型乳房炎主要由鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起。本次調(diào)查采集199份奶樣中，共檢出葡萄球菌53株。從引起奶牛乳房炎病原菌的檢出率來(lái)說(shuō)，金黃色葡萄球菌檢出率為20.10%，表皮葡萄球菌檢出率為6.53%，與上述文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果基本相符。張中文等［10］報(bào)道北京部分地區(qū)臨床型乳房炎葡萄球菌占23.81%。殷波等［11］報(bào)道四川省某奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎的病原菌檢出率中金黃色葡萄球菌23.3%、表皮葡萄球菌3.3%。袁永隆等［12］報(bào)道臨床型乳房炎中葡萄球菌占17.14%。可見(jiàn)，不同地區(qū)引起奶牛乳房炎的葡萄球菌的檢出率僅存在細(xì)微差別。

表3 葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test of Staphylococcus

結(jié)果顯示，引起天津市奶牛乳房炎的葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、丁胺卡那霉素高度敏感，因此為有效控制此葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，可首選以上4種抗生素藥物。本研究結(jié)果與王登輝等［13］報(bào)道的乳樣中分離出的金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢和環(huán)丙沙星敏感相一致，與馬曉艷等［14］研究金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星高度敏感顯示也相吻合，但李飛等［15］研究表明金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率卻在80%以上。

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IDENTIFICATION AND DRUG SENSITIVITY TESTING OF STAPHYLOCOCCUS STRAINS OF COW MASTITIS IN TIANJIN

MA Teng-yu1， CHEN Li-li2， WANG Zhi3， BAINAREN Tu-ya3
（1. Tianjin Food Group Company Limited， Tianjin 300074， China； 2 Tianjin Dairy Development Center， Tianjin 300384， China；3. Tianjin Jialihe Animal Husbandry Company Limited， Tianjin 300402， China）

The objective of this experiment was to perform isolation， identification and drug sensitivity analysis of Staphylococcus strains from cow mastitis. The Staphylococcus strains were recognized through blood agar cultivation characteristics， gram staining and biochemical identification test. Total 53 Staphylococcus strains were obtained from 199 milk samples， including 40 strains of Staphylococcus aureus and 13 strains Staphylococcus of Epidermis . All of these Staphylococcus strains were signifi cantly sensitive to Cefotaxime， Ciprofl oxacin， Enrofl oxacin and Amikacin， which might be used to treat cow mastitis.

Cow； mastitis； Staphylococcus； drug sensitivity test

S852.61

A

1674-6422（2015）06-0063-05

2015-09-15

馬騰宇，男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事奶牛疫病檢測(cè)

陳麗麗，E-mail：chenLiLi0609@163.com