何再平，王 權(quán)，陳永軍，劉迎春，韓先干，王少輝，白雪瑞，劉永杰，蔣 蔚

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095）

·研究論文·

致病性副溶血弧菌三重PCR檢測方法的建立和評價

何再平1，2，王 權(quán)1，陳永軍1，劉迎春1，韓先干1，王少輝1，白雪瑞1，2，劉永杰2，蔣 蔚1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095）

根據(jù)副溶血弧菌種特異性基因（toxR）、耐熱直接溶血素基因（tdh）和相對耐熱直接溶血素基因（trh）為靶基因分別設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3對引物能分別特異性地擴(kuò)增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能擴(kuò)增出toxR基因，不含溶血素基因的菌株（tdh-/trh-）僅擴(kuò)增出1條目的片段，而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌則分別擴(kuò)增出2條（tdh+/trh-或tdh-/trh+）和3條（tdh+/trh+）特異性條帶。檢測其他非副溶血弧菌的供試菌，則不出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶。人工模擬樣品檢測結(jié)果顯示對致病性副溶血弧菌的最低檢測濃度為103CFU/mL。結(jié)果表明該多重PCR檢測方法具有較好的特異性和靈敏性，對檢測致病性副溶血弧菌有重要意義。

副溶血弧菌；種特異性基因；溶血素基因；多重PCR；檢測

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）被認(rèn)為是引起人類食源性疾病的最重要的病原之一，該菌主要存在于海產(chǎn)品中，食用未熟或生的帶有病原菌的食物后出現(xiàn)腸胃炎、菌血癥甚至死亡［1，2］。此外，該菌可引起多種水產(chǎn)動物（魚、蝦、貝、蟹等）感染發(fā)病，尤其是對凡納濱對蝦危害嚴(yán)重［3，4］。隨著海產(chǎn)品消售量日益增加，加強(qiáng)對海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的檢測也越來越重要，建立一種快速、靈敏性和特異性較高的檢測方法對人類的健康至關(guān)重要。

致病性副溶血弧菌主要毒力因子可以產(chǎn)生多種溶血素，耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）是其公認(rèn)的重要毒力因子［5，6］。TDH神奈川現(xiàn)象呈陽性，除此還具有多種生物學(xué)活性，例如溶血活性、腸毒性、細(xì)胞毒性和心臟毒性。該毒素經(jīng)100℃熱處理后約10 min， 生物活性仍不會喪失，故命名為耐熱直接溶血素［6，7］。TRH 是副溶血弧菌另外一個重要的致病因子，60℃處理10 min生物活性就喪失。TRH的氨基酸序列與TDH氨基酸序列同源性將近67%，且兩者存在相近的作用方式，同TDH一樣也具有細(xì)胞毒性和腸毒性，但引起溶血的敏感紅細(xì)胞種類與TDH不同，故稱為耐熱相關(guān)溶血毒素（TRH）［8］。致病性副溶血弧菌菌株一般含有溶血素基因tdh和/或trh，而非致病性副溶血弧菌一般不含有這兩個基因。另外，toxR基因已在副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）等很多弧菌中被發(fā)現(xiàn)，同時異種之間的toxR基因核苷酸序列保守性較高，是弧菌科種間鑒定的良好分子靶標(biāo)［9］。

采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法檢測臨床和食物中的毒力菌株比較困難，一些生物化學(xué)和微生物學(xué)的檢測方法費時且工作量大。因此，建立一種既能鑒別副溶血弧菌，又能確定是否為攜帶溶血素基因（tdh和/或trh）的致病性副溶血弧菌的檢測方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株 副溶血弧菌ATCC33847購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；副溶血弧菌ATCC17802和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；其余副溶血弧菌由本實驗室分離和保存。副溶血弧菌各菌株溶血素基因攜帶情況如下：菌株ATCC33847、VPh503、VPh510、VPSHJLA和VPSHJLC為tdh+trh-；菌株ATCC17802和VPh66為tdh-trh+；VPh67、VPh299、VPh56和VPh503為tdh+trh+；菌株VP24、VP35、VP50、VP65和VP72為tdh-trh-。霍亂弧菌以及其他常見食源性細(xì)菌大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌等菌株為本實驗室保存株。

1.2 試劑 蛋白胨、酵母提取物、TCBS培養(yǎng)基購自英國OXOID公司；科瑪嘉弧菌顯色瓊脂購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；DNA Marker 購自大連寶生物公司；2×PCR TaqMix 購自廣州東盛生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自美國Axygen公司；其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已有文獻(xiàn)和序列，分別設(shè)計鑒別副溶血弧菌的種特異性基因（toxR）和主要溶血素基因（tdh和trh）的引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列、退火溫度及擴(kuò)增片段大小見表1。

表1 PCR 反應(yīng)引物、退火溫度和目的片段長度列表Table 1 PCR primers， anneal temperature and product size

1.4 細(xì)菌DNA提取 取1 mL新鮮培養(yǎng)菌液于離心管中，10 000×g離心2 min，棄去上清，收集沉淀；根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海天根生物技術(shù)有限公司）說明書提取細(xì)菌DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單重PCR特異性檢測 以副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌及其他供試菌的DNA為模板，分別檢測3對引物的特異性。各引物進(jìn)行單重PCR的反應(yīng)體系（25μL）：PCR 2×Mix 12.5 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板1 μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果，將回收的目的基因分別與載體pGEM-T在16℃下連接過夜，之后轉(zhuǎn)入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化菌接種于含100 μg/ mL氨芐青霉素的LB瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)12～20 h。挑取菌落，接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增確定后由上海英駿有限公司進(jìn)行測序分析。

1.6 單重PCR敏感性檢測 將TCBS平板上的副溶血弧菌單菌落接種3%牛肉浸膏培養(yǎng)基，200 r/min、37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，在含3% NaCl的LB平板上計數(shù)。將各菌樣以106CFU /mL等體積混合后，用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋為106～100CFU /mL。各梯度取1 mL菌液，采用試劑盒提取DNA模板，用3對引物分別進(jìn)行單重PCR，反應(yīng)條件同1.5，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。

1.7 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 從模板量、退火溫度、退火時間和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系：PCR 2× Mix 12.5μL，3對上下游引物（10 pmol/μL）分別加：0.5 μL（toxR F/R）、0.5 μL（tdh F/R）、1 μL（trh F/R），模板2 μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s；退火溫度從55℃至65℃設(shè)10個梯度，45 s； 72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。選擇最佳反應(yīng)體系及退火溫度后，對退火時間進(jìn)行優(yōu)化，退火時間分別設(shè)為為30 s、45 s、1 min。最后對循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將循環(huán)參數(shù)分別設(shè)為20、30、40個循環(huán)。

1.8 多重PCR引物特異性分析 分別選取tdh+/trh+、tdh+/trh-、tdh-/trh+、tdh-/trh-的副溶血弧菌菌株以及其他供試菌的DNA為模板，以最佳反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，分析多重PCR特異性分析。

1.9 多重PCR敏感性的檢測 將細(xì)菌基因組DNA用滅菌純化水作10倍梯度稀釋，以最佳反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，分析多重PCR的檢測靈敏度。

1.10 人工布菌樣品的檢測 在當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場采集牡蠣，超凈臺無菌操作剪碎，用FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)打碎為勻漿，稱取10 g樣品與90 mL滅菌的3%NaCl堿性蛋白胨水混勻。取過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌（tdh+/trh+）菌懸液進(jìn)行涂平板計數(shù)，10倍梯度稀釋。對106、105、104、103、102CFU/mL這5個稀釋度的菌液各取1 mL接種至牡蠣肉中，分別提取基因組DNA，未加菌的樣品作為陰性對照，采用多重PCR進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR特異性評價 利用針對toxR、trh、tdh基因的3對引物分別進(jìn)行單重PCR，以副溶血弧菌陽性菌株的DNA為模板，能分別特異性地擴(kuò)增出368、486、269 bp大小的目的條帶，同時測序結(jié)果也表明3個基因擴(kuò)增正確，不攜帶相應(yīng)毒力基因的副溶血弧菌和其他供試菌株均無相應(yīng)大小的條帶出現(xiàn)（見圖1A、B和C），表明設(shè)計的引物有較高的特異性。

2.2 單重PCR敏感性評價 以倍比稀釋的副溶血弧菌DNA為模板，單重PCR分別檢測trh、tdh、toxR基因，當(dāng)這3種引物溶度分別為2、0.5、0.5 μL時，3種單重PCR的最低檢測限均為1×102CFU/mL（圖2）。

2.3 多重PCR體系優(yōu)化 在25 μL反應(yīng)體系中，退火溫度在55℃～65℃時，3對引物均出現(xiàn)較明顯的目的條帶（圖3A）。退火時間在30 s時tdh產(chǎn)物的條帶較模糊，退火時間在45 s和1 min時，3條目的條帶均較清晰（圖3B）。循環(huán)參數(shù)為30時，目的條帶最明顯（圖3C）。因此，用于檢測副溶血弧菌毒力因子的多重PCR，最佳反應(yīng)體系確定為（25 μL）：Mix 10μL，上下游引物（10 pmol/μL）分別為trh 2 μL、tdh 0.5 μL、toxR 0.5 μL，模板2 μL，ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s；退火溫度60℃，退火時間45 s；72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

圖1 單重PCR特異性檢測Fig.1 Specifi city test of single plex PCR

圖2 單重PCR敏感性檢測Fig.2 Sensitivity test of single plex PCR

圖3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions for multiplex PCR

2.4 多重PCR特異性評價 多重PCR檢測方法分別對tdh+/trh+、tdh+/trh-、tdh-/trh+和tdh-/trh-副溶血弧菌菌株，及其他細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測（圖4），陽性菌株都出現(xiàn)了相應(yīng)大小的特異性條帶，而陰性菌均未出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果表明該多重PCR檢測方法有較高的特異性。

2.5 多重PCR敏感性檢測 選取tdh+/trh+的副溶血弧菌菌株培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，各取1 mL提取 DNA，進(jìn)行多重PCR檢測，在102CFU/mL時仍能檢測到toxR目的條帶，在103CFU/mL時能明顯看到trh和tdh的條帶（圖5）。因此對于致病性副溶血弧菌，多重PCR的檢測限為103CFU/mL。

2.6 人工模擬樣品檢測限的測定結(jié)果 多重PCR檢測結(jié)果顯示，未接種副溶血弧菌的樣品未出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，說明樣品在處理前未被污染。副溶血弧菌濃度為102CFU/mL時，可以檢測到toxR基因，但是trh和tdh的擴(kuò)增條帶比較模糊。副溶血弧菌濃度為103CFU/mL時，3個條帶均較清晰（圖6）?？梢?，本研究建立的多重PCR方法對致病性副溶血弧菌的檢測限為103CFU/mL。

3 討論

近些年，副溶血弧菌作為一個重要致病因子越來越受到人們重視。據(jù)我國國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)2003～2007年報告顯示，副溶血弧菌已超過大腸埃希氏菌和沙門氏菌成為我國最主要的食源性致病菌［10］。有學(xué)者在分子流行病學(xué)調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，可用作副溶血弧菌檢測的靶基因主要有：編碼溶血素的tlh基因、編碼促旋酶的gyrB基因序列、編碼毒力操縱子調(diào)節(jié)基因toxR、副溶血弧菌的16S核糖體RNA基因（16S rRNA）和伴侶蛋白基因groEL等［11，12］。選用上述特異性靶基因?qū)Ω比苎【M(jìn)行鑒定均具有良好的特異性。但是部分基因并不能有效區(qū)分副溶血弧菌和其他細(xì)菌，例如，副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌和坎氏弧菌的16S rRNA 和23S rRNA基因序列具有高度的相似性，用這兩個基因為靶基因檢測副溶血弧菌有一定的困難［13，14］。相比之下，許多研究發(fā)現(xiàn)toxR基因用于檢測副溶血弧菌時有較強(qiáng)的特異性，可以將副溶血弧菌和其他菌種準(zhǔn)確地檢測出，并且所有副溶血弧菌均能擴(kuò)增到toxR基因［15］。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)toxR和groEL基因的種特異性均非常好，因此本試驗選取toxR基因作為鑒別副溶血弧菌和其他細(xì)菌的種特異性基因。

圖4 多重PCR特異性檢測Fig.4 Specifi city test of multiplex PCR

圖5 多重PCR敏感性檢測結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of multiplex PCR

圖6 模擬樣品的多重PCR檢測結(jié)果Fig.6 Detection of artifi cially infected samples by multiplex PCR

為了進(jìn)一步鑒別致病菌株和非致病菌株，還需檢測副溶血弧菌重要的毒力基因。研究認(rèn)為TDH和TRH是副溶血弧菌最重要的兩個致病因子，分別由tdh和trh基因編碼，它們單個或同時存在均可造成副溶血弧菌很強(qiáng)的致病力［5，6］，檢測是否含有這兩種毒力因子對確定副溶血弧菌是否對人類健康造成威脅具有重要的意義。目前已建立了關(guān)于以tdh和trh為目標(biāo)基因的分子學(xué)研究方法［16，17］。PCR具有操作簡單、高效、成本低及高靈敏度的優(yōu)點，得到越來越廣泛的運用。本研究建立了以菌種特定基因和毒力基因為靶基因的多重PCR檢測方法。種特異性基因toxR可以將副溶血弧菌和其他細(xì)菌區(qū)別開來，毒力基因tdh和trh可以鑒別非致病性和致病性副溶血弧菌，同時還能確定致病菌是同時具有還是分別具有tdh和trh毒力基因，并且通過電泳可以很容易區(qū)分開3個基因。將細(xì)菌按梯度連續(xù)稀釋后，進(jìn)行人工模擬布菌試驗，可以檢測到102～103CFU/mL以上的致病性副溶血弧菌。

本研究建立的多重PCR不僅能夠準(zhǔn)確地檢測出副溶血弧菌，而且可以區(qū)分非致病性和致病性副溶血弧菌，進(jìn)一步可確定致病菌株含有單個還是兩個不同溶血素毒力基因的情況，可用于食品安全檢測、診斷和分類研究。

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DEVELOPMENT AND EVALUATION ON A MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF PATHOGENIC VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

HE Zai-ping1，2， WANG Quan1， CHEN Yong-jun1， LIU Ying-chun1， HAN Xian-gan1，WANG Shao-hui1BAI Xue-rui1，2， LIU Yong-jie2， JIANG Wei1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. Key Laboratory of Animal Disease Diagnostic and Immunology of the Ministry of Agriculture， College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

In order to identify Vibrio parahaemolyticus that produce toxin genes， a rapid， sensitive and specifi c multiplex PCR assay was developed in this study. Three pairs of primers were designed to detect species-specifi c gene （toxR）， heat direct hemolysin gene （tdh） and heat-related hemolysin gene （trh） of V.parahaemolyticus， respectively. The reaction conditions for the multiplex PCR were optimized to establish a rapid， sensitive and convenient method for detection of pathogenic V. parahaemolyticus in aquatic animals. The results showed that the multiplex PCR produced specifi c amplicons with expected sizes 368 bp， 269 bp and 486 bp. The three pairs of primers amplifi ed diff erent V. parahaemolyticus strainss： one band for tdh-/trh-V. parahaemolyticus， two bands for tdh+/trh-or tdh-/trh+V. parahaemolyticus and three bands for tdh+/trh+V. parahaemolyticus. The multiplex PCR did not detect any other bacteria. The detection limit of the multiplex PCR was 1×103CFU/mL for pathogenic V. parahaemolyticus. Development of the multiplex PCR off ers an eff i cient way for high sensitive and special detection of pathogenic V. parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus； species-specifi c gene； hemolysin gene； multiplex-PCR； detection

S852.612

A

1674-6422（2015）06-0048-08

2015-09-15

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目（13DZ0502702）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303045）

何再平，女，碩士，主要從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究

蔣蔚，E-mail：jiangweijw99@163.com；劉永杰，liuyongjie@njau.edu.cn