李天芝，于新友，王 艷，苗立中，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

副豬嗜血桿菌(Hps)可引起豬以纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的傳染病[1-3]。早在1910 年，德國科學(xué)家Glasser 首次報告了Hps 引起的豬纖維素性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎[4]。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病發(fā)病率逐年上升，已成為一個全球性的重要豬病[5]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失，嚴重威脅著全世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。近年來，我國各主要養(yǎng)豬省份均有該病的相關(guān)報道。2014 年4 月份，山東省某豬場15%斷奶仔豬陸續(xù)出現(xiàn)各種臨床癥狀，如精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、咳嗽，腹式呼吸，皮膚黏膜發(fā)紺，關(guān)節(jié)腫脹、跛行等。發(fā)病豬死亡率為30%，病死豬經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)肺與胸壁粘連，心外膜與心肌粘連，呈現(xiàn)“絨毛心”外觀，心包積水，腹腔內(nèi)有淡黃色污濁的液體，肝臟與腹壁粘連，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有漿液性淡黃色滲出物，關(guān)節(jié)周圍皮下組織與肌腱水腫。筆者無菌操作取病豬的心血、心包積液、關(guān)節(jié)液進行分離鑒定，成功分離到1 株副豬嗜血桿菌。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑和實驗動物

病料為采自山東省某豬場的疑似副豬嗜血桿菌感染豬心血、心包積液、關(guān)節(jié)液。金黃色葡萄球菌、草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復(fù)紅染液由本試驗室提供，生化試驗用各種試劑、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，DL2000 Marker、TagDNA 聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司，胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，NAD、基因組DNA 小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。20 只16～20 g Balb/c小鼠購自山東省實驗動物中心。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照GenBank 登錄的副豬嗜血桿菌16SrRNA 基因（GU226401），設(shè)計1 對引物，引物序為F：5'-AGTATC GGGAGATGAAAGAC-3'；R：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT -3'，擴增片段長度為1 083 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細菌分離、培養(yǎng)

將采集的豬心血劃線接種于含NAD 的TSA 平 板，37 ℃培 養(yǎng)24 h，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢。

1.4 衛(wèi)星現(xiàn)象

挑取分離菌分別劃線于2 個鮮血瓊脂平板上，在其中一個培養(yǎng)基中央作2條平行劃線狀接種金黃色葡萄球菌，于5% CO2環(huán)境37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察生長結(jié)果。

1.5 因子依賴試驗

將分離菌接種于同時添加了NAD和小牛血清的TSA 平板和只添加小牛血清的TSA 平板，于5% CO2環(huán)境37 ℃培養(yǎng)48 h，檢查其生長特性及對V 因子的依賴性。

1.6 生化鑒定

將分離菌用含NAD 和小牛血清的TSA 平板48 h 純培養(yǎng)后，進行糖發(fā)酵試驗及其他生化試驗。

1.7 PCR 鑒定

挑取含NAD 的TSA 平板上單個菌落，接種于含5%小牛血清和NAD 的TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min，培養(yǎng)24 h，用基因組DNA 小量抽提試劑盒提取分離菌DNA 作模板，進行PCR 擴增。反應(yīng)體系如下：10×Buffer 25μL，引 物F 和R 各2.5μL（15 pmol/L）。dNTP 5μL，TagDNA 聚合酶0.5μL，模板2μL，加水補足至50μL。擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物回 收后，與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，將初步鑒定為陽性的重組菌送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.8 Balb/c 小鼠致病性試驗

20 只Balb/c 小 鼠， 隨 機 分2組，每組10 只。無菌吸取上述經(jīng)生化鑒定的分離菌培養(yǎng)物分別腹腔注射10 只試驗組Balb/c 小鼠，每只注射0.5 mL(6×109CFU/mL)，10 只 對 照分別腹腔注射0.5 mL TSB 培養(yǎng)基作對照。注射后Balb/c 小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況。并取死亡Balb/c小鼠的心血進行細菌分離。

1.9 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散法將所分離的副豬嗜血桿菌24 h TSB 純培養(yǎng)物10 倍稀釋后，接種于含NAD 的TSA 平板上，每個平板接種0.2 mL，并將其涂布均勻。然后用無菌鑷子將各種藥敏片分別平放在培養(yǎng)基表面，保持紙片間適度距離，37 ℃溫箱48 h。觀察結(jié)果并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

在TSA 固體培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，形成表面光滑、濕潤、圓形、無色透明，直徑為1～2 mm 的菌落。挑取單個菌落涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為短桿狀的革蘭氏陰性菌。

2.2 衛(wèi)星現(xiàn)象

在金黃色葡萄球菌兩側(cè)可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌愈近菌落生長越好，愈遠菌落越小，呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，而在未接種金黃色葡萄球菌的平板則不見細菌生長。

表1 副豬嗜血桿菌濱州株分離株生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 V 因子依賴試驗結(jié)果

在未添加NAD 的TSA 平板未見細菌生長，而在添加NAD 的TSA 平板上生長良好，說明其生長依賴V 因子。

2.4 生化試驗結(jié)果

由表1 可知，分離的副豬嗜血桿菌生化結(jié)果為依賴NAD、不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象、接觸酶試驗反應(yīng)陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，氧化酶、脲酶、吲哚試驗、V-P試驗均呈陰性。能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、山梨糖、半乳糖、核糖、蔗糖、海藻糖，不能發(fā)酵甘露糖、木糖、蜜二糖、棉子糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇、甘露醇。

2.5 PCR 鑒定

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小為1 083 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1 副豬嗜血桿菌濱州株分離株P(guān)CR檢測結(jié)果

擴增產(chǎn)物測序結(jié)果如下：

AGTATCGGGAGATGAAAGACTGG GACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT GAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGG TGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCGACG ATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATATTGCACAATGGGGGGAACC CTGATGCAGCCATGCCGCGTGAATGA AGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCT TTCGGTGATGAGGAAGGGTGGTGTTT TAATAGAACATTACATTGACGTTAGT CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCGAGCGTTAATCGGAATGACTGG GCGTAAAGGGCACGCAGGCGGTGACT TAAGTGAGATGTGAAAGCCCCGAGCT TAACTTGGGAATTGCATTTCATACTG GGTTGCTAGAGTATTTTAGGGAGGGG TAGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGAA GGCGAAGGCAGCCCCTTGGGAAAATA CTGACGCTCATGTGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCTGTAAACGCTGTCGATT TGGGGATTGGGCTTAGAGCTTGGTGCC CGTAGCTAACGTGATAAATCGACCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT ACTCTTGACATCCTAAGAAGAACTCA GAGATGAGTTTGTGCCTTCGGGAACT TAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA TCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGG AACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAA ACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGG CTACACACGTGCTACAATGGTGCATA CAGAGGGTGACGAAGCC

將測序結(jié)果與參照的GenBank 登錄的副豬嗜血桿菌16SrRNA 基因的相似性為100%。

2.6 Balb/c 小鼠致病性試驗結(jié)果

分離菌的TSB 純培養(yǎng)物注射試驗組的Balb/c 小鼠24 h 后，均表現(xiàn)精神沉郁、毛色豎起蓬亂、反應(yīng)遲鈍、扎堆、食欲廢絕；對照組無此現(xiàn)象。至48 h全部死亡，剖檢可見皮下出血、腹腔有多量滲出、肺臟嚴重出血、腎臟均有出血點。用心血涂片革蘭氏染色鏡檢。發(fā)現(xiàn)有短桿狀的革蘭氏陰性菌，PCR 擴增結(jié)果為Hps 陽性，可確定小白鼠為Hps致死。對照組Balb/c 小鼠未見異常。

表2 副豬嗜血桿菌濱州株分離株藥物敏感性試驗結(jié)果 mm

2.7 藥敏試驗結(jié)果

由表2 可知，分離菌對頭孢曲松、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素、替米考星高度敏感；對恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素中度敏感；對甲氧芐氨嘧啶、阿莫西林、鏈霉素、青霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等耐藥。

3 討論

副豬嗜血桿菌很嬌氣很難分離培養(yǎng)，對生長條件要求很苛刻，分離率不高，病料的新鮮程度對其成功分離影響很大，病豬死亡時間超過 12 h 采集的病料，則幾乎不可能分離到 Hps。初次分離培養(yǎng)需要供給5%～10%的CO2促進生長，常用的培養(yǎng)基為胰蛋白大豆瓊脂(Tryptci Syo Agar，TSA)和胰蛋白大豆肉湯(Tryptci Soy Borht，TsB)，需要在培養(yǎng)基中添加終濃度是0.000 1% 的NAD 和5% 的 犢 牛 血清，細菌才能生長。在分離培養(yǎng)的過程中，很容易被污染。臨床上豬群大劑量抗生素的應(yīng)用更增加了該菌的分離難度。該菌培養(yǎng)24～48 h 后，革蘭氏染色，鏡檢革蘭氏陰性菌，通常形態(tài)為球狀、球桿狀、短桿狀等，其中以短桿狀的革蘭氏陰性菌居多；培養(yǎng)72 h 后，其形態(tài)為桿狀或長絲狀，長絲狀較多。本試驗分離的1 株副豬嗜血桿菌能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、山梨糖、半乳糖、核糖、蔗糖、海藻糖，不能發(fā)酵甘露糖、木糖、蜜二糖、棉子糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇、甘露醇。依賴NAD、不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象、接觸酶試驗反應(yīng)陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，氧化酶、脲酶、吲哚試驗、V-P 試驗均呈陰性，與副豬嗜血桿菌的生化特征一致，該菌株可使實驗組Balb/c 小鼠48 h 內(nèi)全部死亡，表明該分離菌株有一定的致病性。根據(jù)GenBank 登錄的副豬嗜血桿菌16SrRNA 基因（GU226401）設(shè)計引物，擴增出特異性條帶，測序結(jié)果顯示與GenBank 登錄的副豬嗜血桿菌16SrRNA 基因的相似性為100%。藥敏試驗結(jié)果顯示，該分離株對頭孢曲松、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素、替米考星高度敏感，對甲氧芐氨嘧啶、阿莫西林、鏈霉素、青霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等耐藥。副豬嗜血桿菌的分離鑒定，為臨床診治提供了依據(jù)，為進一步開展該菌株的分子生物學(xué)研究和自家滅活菌苗的制備等奠定了基礎(chǔ)。

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