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        內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

        2015-12-27 12:25:38竇紅偉田家寧夏代剛蒙小云
        豬業(yè)科學(xué) 2015年3期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)窺鏡胚胎克隆

        竇紅偉,鄭 華,田家寧,夏代剛,蒙小云,李 勇,石 偉

        (1. 深圳市農(nóng)牧實業(yè)有限公司,廣東 深圳 518023;2. 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司,廣東 深圳 518083)

        內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植研究

        竇紅偉2,鄭 華1*,田家寧2,夏代剛1,蒙小云1,李 勇2,石 偉1

        (1. 深圳市農(nóng)牧實業(yè)有限公司,廣東 深圳 518023;2. 深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司,廣東 深圳 518083)

        傳統(tǒng)的手術(shù)法開展豬克隆胚胎移植會使受體母豬的創(chuàng)傷比較大,術(shù)后恢復(fù)慢和容易傷口感染等會影響克隆胚胎著床,從而影響移植成功率;同時,受體利用率低。為摸索新的豬克隆胚胎移植方法,和提高受體在胚胎移植中的利用次數(shù),降低受體手術(shù)應(yīng)激,應(yīng)用內(nèi)窺鏡開展了20頭豬克隆胚胎移植試驗,結(jié)果分娩1頭(4頭活仔),移植成功率僅為5%。研究表明,內(nèi)窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的,但還需要繼續(xù)摸索總結(jié),才能提升移植成功率,熟練和標準化操作是內(nèi)窺鏡移植能否成功的關(guān)鍵。

        克??;豬胚胎移植;內(nèi)窺鏡

        目前豬克隆胚胎移植的主流方法是手術(shù)法[1]。傳統(tǒng)的手術(shù)法開展豬克隆胚胎移植會使受體母豬的創(chuàng)傷比較大,術(shù)后恢復(fù)慢,容易傷口感染,從而影響克隆胚胎著床和移植成功率。借鑒克隆羊技術(shù)[2],內(nèi)窺鏡法進行豬克隆的胚胎移植是值得嘗試的。內(nèi)窺鏡法屬于微創(chuàng)手術(shù),切口很小,只需在腹部切開1 cm左右的2~3個小口,將腹腔鏡插入腹腔,在腹腔鏡引導(dǎo)下,將胚胎植入子宮。這種方法雖然仍需要麻醉和類似于常規(guī)手術(shù)的程序,但由于手術(shù)切口小,切口恢復(fù)快,術(shù)后反應(yīng)輕,出血腫脹時間可大大減少,不但降低了手術(shù)的感染概率,對受體母豬損傷和應(yīng)激亦小得多,故可增加手術(shù)的精確性及安全性。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        腹腔內(nèi)窺鏡、顯示器、氣腹機、冷光源、CO2氣體、受體母豬、培育好的克隆胚胎數(shù)枚、無菌操作實驗室、手術(shù)臺、手術(shù)麻醉劑、氧氣、笑氣及呼吸麻醉機系統(tǒng)一套、手術(shù)刀、縫合針線等。要求試驗?zāi)肛i單獨飼養(yǎng),術(shù)前徹底清潔消毒;移植的胚胎要求發(fā)育良好,嚴格按照恒溫38.5 ℃條件保存;手術(shù)前對手術(shù)室進行24 h紫外線照射處理;對參與手術(shù)的人員手術(shù)前做好消毒凈化工作;手術(shù)所用的刀具、耗材做好消毒無菌工作,確保胚胎移植過程處于無菌操作。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 供體細胞建系及選擇

        1.2.1.1 供體的選擇

        在本試驗開始前,根據(jù)我公司種豬群育種數(shù)據(jù)選擇遺傳指數(shù)高的,生產(chǎn)性能好的公豬作為此次試驗的供體。

        1.2.1.2 組織樣品采集

        保定好供體,采樣人員對供體耳緣周邊進行消毒清理,剃掉皮膚上層的絨毛,用采樣器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉,裝入樣品管,放入專用冷凍箱低溫(4 ℃)保存,運回實驗室進行細胞建系。

        1.2.1.3 細胞建系

        將采好的耳緣組織樣品送至深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司進行細胞建系,并傳代培養(yǎng)和超低溫液氮凍存。

        1.2.1.4 克隆胚胎構(gòu)建

        將所建細胞系傳至P5~P6,利用手工克隆技術(shù)進行克隆胚胎的構(gòu)建,并且體外培養(yǎng)至第6天,發(fā)育至囊胚。用于移植的胚胎,挑選原則是盡量選取形態(tài)良好、擴張充分、內(nèi)細胞團明顯的囊胚。

        1.2.2 胚胎受體的選擇

        胚胎受體的選擇標準:分娩過程長短正常、異常仔豬少、產(chǎn)后恢復(fù)快、未有子宮炎癥狀及奶水好的母豬,同時選擇斷奶發(fā)情要在7 d以內(nèi)的母豬,而且發(fā)情表現(xiàn)要很明顯,本試驗由于研究經(jīng)費的限制和減小對試驗場生產(chǎn)沖擊,對受體母豬的選擇沒有嚴格執(zhí)行這些標準,而是選取了一些斷奶較長時間發(fā)情、空懷、返情和后備母豬。

        1.2.3 移植時間

        1.2.3.1 受體斷奶時間

        在確定了手術(shù)移植時間后,反推母豬斷奶時間,即手術(shù)時間反推5 d為發(fā)情日期,發(fā)情日期反推6 d為斷奶日期。

        1.2.3.2 移植胚胎的胚齡

        經(jīng)過手工克隆重構(gòu)胚,為發(fā)育至6 d的囊胚。

        1.2.4 手術(shù)前的準備工作

        1.2.4.1 移植胚胎的準備

        用專門的撿胚器對擬移植的胚胎進行分撿并裝入麥管,每頭受體母豬準備2個麥管,每個麥管大約裝入30枚胚胎。將裝好胚胎的麥管放入恒溫的運輸箱。

        1.2.4.2 受體母豬

        發(fā)情后對受體母豬實行單欄飼養(yǎng),術(shù)前做好清洗及消毒工作,手術(shù)前12 h禁食。

        1.2.4.3 手術(shù)儀器準備和檢查

        準備手術(shù)器械、高壓蒸汽鍋、手術(shù)服、外科手術(shù)手套、口罩、縫線、洞巾、磺胺、生理鹽水、碘酊、酒精、酒精棉、紙巾、消毒紗布。對所有進入手術(shù)室的器材都要進行滅菌處理。首先確定手術(shù)需要幾套滅菌器材,滅菌前用洗潔精清洗器材并用蒸餾水洗凈,然后通過高壓蒸汽鍋進行高壓高溫滅菌;高壓蒸汽鍋在103.4 kPa(1.05 kg/cm2)蒸汽壓下,溫度達到121.3 ℃,維持15~20 min,即可達到滅菌的效果;已滅菌的物品做好標記,與未滅菌的物品分開保存,以免弄錯。

        1.2.5 豬克隆胚胎的移植手術(shù)

        1.2.5.1 操作準備與消毒

        1)把受體母豬趕到緩沖間,用套嘴鋼絲繩保定,注射誘導(dǎo)麻醉劑復(fù)方獸用氯胺酮2 mL。

        2)把受體豬抬到手術(shù)臺上,用加新潔爾滅的清水清洗腹部,剃毛,擦干。

        3)把受體豬套上呼吸面罩,打開氧氣流量計開關(guān)到0.8 L/min(浮子小球浮動到刻度線),接著將異氟烷開到最大5%,最后打開笑氣(N2O)流量計到0.5 L/min。

        4)用75%酒精噴灑手術(shù)器械載臺,用消毒紙巾擦干。

        5)手術(shù)人員戴口罩和帽子,穿手術(shù)服,最后戴手術(shù)手套,注意穿戴規(guī)則和順序,操作時切忌碰到手套的外面,防止污染。

        6)用手術(shù)鑷夾持碘酊消毒手術(shù)部位(由內(nèi)往外,成螺旋狀),再噴灑75%酒精脫碘,然后用生理鹽水沖洗,酒精和生理鹽水的噴灑方法同碘酊消毒一樣,由內(nèi)往外,不能來回重復(fù)。最后用消毒紗布拭干微創(chuàng)手術(shù)部位及外圍。

        1.2.5.2 微創(chuàng)開刀

        為了在受體母豬體內(nèi)能夠準確找到子宮部位,需要開3個小創(chuàng)口。首先用手術(shù)刀在肚臍附近割一個2 cm的創(chuàng)口,插入氣腹針,手感穿過肌肉后的鏤空感,馬上停止,連上氣腹機軟管,慢慢加大腹壓,直到加到最大,觀察受體腹部變化,并叩打腹部,聽聲音并同時看氣腹機的讀數(shù),如果進氣的話,讀數(shù)會不斷增加。當(dāng)讀數(shù)達到4~5 L的時候,受體腹部會有明顯的鼓起。

        1.2.5.3 引入內(nèi)窺鏡

        把光纖和光源連接起來,把內(nèi)窺鏡連線和成像儀連接起來,當(dāng)受體腹部有明顯鼓起時,拔下氣腹針,插入穿刺器,同時把氣腹機軟管連接穿刺器上,拔出套管內(nèi)的穿刺針,插入連接成像儀和光源的內(nèi)窺鏡,觀察腹腔內(nèi)部情況。把內(nèi)窺鏡鏡頭對準腹壁相應(yīng)位置,插入另外2個穿刺器。

        1.2.5.4 尋找輸胚位置

        穿刺器插好后,拔出穿刺針,插入2把抓取鉗,內(nèi)窺鏡與抓取鉗配合找到子宮角,并順著子宮角用2把鉗子交替夾持,找出卵巢,觀察卵巢的排卵情況,可以剝開輸卵管傘,觀察后再把卵巢用輸卵管傘包起來。找出宮管接合處,用抓取鉗夾持子宮角,調(diào)整好輸胚角度。

        1.2.5.5 輸胚

        調(diào)整到最佳位置后,放開另一把抓取鉗,并把16#鈍性打孔針經(jīng)穿刺器套管伸入腹腔,在宮管結(jié)合部打孔,避免在可見血管稠密處進針,將裝有胚胎的注射針經(jīng)該孔伸入子宮腔中,徐徐推入豬克隆胚胎。輸胚完成后用止血鉗夾持小孔一段時間,防止出血,另一側(cè)子宮同上操作。

        1.2.5.6 縫合

        輸胚結(jié)束后,放空腹腔內(nèi)的氣體,確保放空后拔下穿刺器套管,傷口撒上磺胺后縫合1~2針,手術(shù)即結(jié)束。

        1.2.6 術(shù)后管理及觀察

        待受體母豬完全清醒后,單獨飼養(yǎng)管理,視傷口愈合情況決定是否需要相應(yīng)治療。如恢復(fù)良好,按照配種后1個月母豬標準進行飼養(yǎng)管理,在28 d時通過B超進行查孕,確定受體是否懷孕。

        2 結(jié)果與分析

        表1 內(nèi)窺鏡法豬克隆胚胎移植試驗結(jié)果

        2013年5月15日至8月26日間,我們共開展了20頭母豬的內(nèi)窺鏡法移植試驗。從移植效果來看,18頭受體母豬都返情。L12003504號母豬雖然沒有返情但剖腹產(chǎn)時發(fā)現(xiàn)無仔,也沒有死胎和木乃伊,應(yīng)該是胚胎死亡后被吸收了。L9033714號母豬剖腹產(chǎn)4頭活仔。內(nèi)窺鏡法胚胎移植20頭母豬成功1頭,分娩率達到5%(1頭/20頭),移植效果不甚理想。但既然有了1頭受體母豬分娩,說明內(nèi)窺鏡法開展豬克隆胚胎移植是可行的,只是還需要繼續(xù)摸索總結(jié),才能提升移植成功率。

        3 討論

        本研究嘗試內(nèi)窺鏡法進行豬克隆胚胎移植,但移植成功率較低,究其原因在于受體母豬的選擇。

        3.1 受體母豬的選擇

        受體母豬因素對克隆豬生產(chǎn)效率的影響是顯著的[3]。我們利用腹腔內(nèi)窺鏡開展克隆豬的胚胎移植,只是覺得原理上可行,抱著試試看的心態(tài),為減少對豬場正常生產(chǎn)經(jīng)營的影響,所以選取的受體母豬基本上都是繁殖異常母豬,其中有4頭為返情母豬,7頭為空懷母豬,1頭為后備母豬,只有8頭是斷奶母豬,且基本是推遲發(fā)情的母豬。由于這些受體母豬本身繁殖異常,即便按正常程序配種,其受胎率和分娩率也可能不高,所以造成克隆成功率低。

        3.2 內(nèi)窺鏡操作需要專業(yè)技能,熟練和規(guī)范操作是移植成功的關(guān)鍵

        由于整個試驗過程都是在視野狹窄的內(nèi)窺鏡下進行,操作難度大,力度、角度和位置沒有掌握好,或者熟練度不高都會影響試驗效果。譬如,內(nèi)窺鏡剛插入腹腔時,與腹腔溫度有溫差,如果不對鏡頭進行預(yù)熱,會出現(xiàn)鏡頭結(jié)霧影響操作;插入另外2個穿刺器時,如果力量沒有把握好,不注意腹壁情況,會扎穿腹壁傷到內(nèi)臟;卵巢和子宮角的查找,會延長手術(shù)時間和造成傷害;子宮角打孔會造成穿孔或刺入子宮壁,造成胚胎損失和移植失敗等等。熟能生巧,只有不斷嘗試和總結(jié),提高操作技能,并不斷將操作標準化,才能真正地提高胚胎移植成功率。

        [1] 李旭陽,邳明偉,孫慧敏,等.克隆豬的胚胎移植技術(shù)及其應(yīng)用[J].豬業(yè)科學(xué),2006, 23(2):10-12.

        [2] 王申元,周歡敏,張立,等.不同處理方法對綿羊克隆胚胎的移植比較研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010(1):51-52.

        [3] 衛(wèi)恒習(xí),李秋艷,高鳳磊,等. 胚胎移植方法和受體母豬因素對克隆豬生產(chǎn)效率的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(15):3147-3153.

        2014-11-13)

        國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(編號:CARS-36)、深圳市科技計劃項目(編號:JSA200904011807A)

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