馮小倩, 張 綱, 張慧宇, 馮曉丹, 張 萍, 譚穎徽

(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院口腔科, 重慶 400037)

組胺及組胺受體1在大鼠牙周炎發(fā)病中表達(dá)差異的研究

馮小倩, 張 綱, 張慧宇, 馮曉丹, 張 萍, 譚穎徽

(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院口腔科, 重慶 400037)

目的: 研究組胺及組胺受體1(HR1)在牙周炎發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組(每組20只)，其中實(shí)驗(yàn)組采用正畸絲結(jié)扎法建立牙周炎模型，對照組不作任何處理；建模8周后，分別采用ELISA法檢測各組齦溝液中組胺含量，熒光定量PCR法檢測各組牙齦組織中HR1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：牙周炎組齦溝液中的組胺濃度(35.47± 3.908)μg/L高于正常對照組(19.77± 3.832)μg/L(P<0.05)；牙周炎組牙齦組織中的HR1- mRNA表達(dá)水平低于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論：組胺及HR1對牙周炎的發(fā)病均有一定調(diào)控作用。

牙周炎; 大鼠; 組胺; 組胺受體Ⅰ(HR1)

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1):15]

牙周炎是由牙周致病菌導(dǎo)致牙周組織破壞的慢性感染性疾病，其特點(diǎn)是致病菌及其產(chǎn)物如內(nèi)毒素(LPS)直接破壞，以及免疫細(xì)胞與促炎細(xì)胞因子相互作用而造成牙周支持組織的喪失[1]。在此過程中釋放多種炎癥介質(zhì)可通過相互作用而加重牙周組織的破壞，部分炎性介質(zhì)還可促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，加重骨吸收[2]。組胺是一種以無活性結(jié)合型存在于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞顆粒中的自體活性物質(zhì)，在體內(nèi)由組氨酸脫羧基而成，具有影響多種細(xì)胞反應(yīng)的作用，包括過敏反應(yīng)，炎性反應(yīng)等。最新研究認(rèn)為，組胺是免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控者[3]。體內(nèi)存在的多種細(xì)胞因子均參與促進(jìn)組胺的合成。如TNF- α、IL- 1可與人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM- CSF)協(xié)同誘導(dǎo)嗜堿粒細(xì)胞前驅(qū)細(xì)胞合成組胺；LPS可通過刺激巨噬細(xì)胞而使其合成組胺[4]；細(xì)胞因子IL- 3能與LPS協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成組胺[5]。組胺通過脫顆?，F(xiàn)象由肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放并與組胺受體結(jié)合從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此，研究組胺(Histamine)和組胺受體(Histamine receptor, HR)在機(jī)體應(yīng)答炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制，對于牙周炎進(jìn)程的診斷與治療具有重要意義。本研究通過建立大鼠牙周炎模型并觀察其牙周組織病理變化，同時(shí)檢測齦溝液中組胺表達(dá)水平的改變以及牙齦組織中HR1-mRNA含量表達(dá)的差異，初步探討組胺及其受體在牙周炎癥中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所涉及的動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會許可)；戊巴比妥鈉(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；大鼠組胺檢測試劑盒(RND公司,美國)；酶標(biāo)儀( Bio- Rad 5.0, 美國)；AX80自動研究級系統(tǒng)顯微鏡( Olympus公司,日本)；mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(TaKaRa, 日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎動物模型的建立

取健康雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(220±10)g，于室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)(普通飼料喂養(yǎng))4 d后，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組(n=20)。其中實(shí)驗(yàn)組參照Achong等[6]報(bào)道的方法及標(biāo)準(zhǔn)建立大鼠牙周炎模型(采用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎右側(cè)上頜第一磨牙頸部，并配合Keyes’, sdiet2000牙周炎食譜喂養(yǎng))；對照組不作任何處理，在相同環(huán)境下普通飼料喂養(yǎng)。建模期間定期(每周1次)觀察各大鼠的牙周組織變化情況以及結(jié)扎情況，若結(jié)扎絲脫落或移位則重新結(jié)扎。

1.2.2 常規(guī)組織學(xué)觀察

建模8周后分別從每組中各隨機(jī)抽取10只大鼠，用40 g/L多聚甲醛液心內(nèi)灌注處死后取其右側(cè)上頜第一磨牙及牙周組織；分別用40 g/L多聚甲醛液再次固定、EDTA液脫鈣2周后，常規(guī)脫水、包埋、制作石蠟切片，HE染色觀察結(jié)合上皮、溝內(nèi)上皮、牙齦上皮、上皮下炎細(xì)胞浸潤情況。

1.2.3 齦溝液中組胺含量的測定

組織學(xué)觀察確定牙周炎模型建立成功后，取各組所余的另10只大鼠，用無菌干棉球擦干各大鼠右側(cè)上頜第一磨牙的牙面并隔濕；然后將3個(gè)已稱量的Whatman40號濾紙條(2 mm×20 mm)分別插入各取樣牙的頰側(cè)近中、中央及遠(yuǎn)中3 個(gè)位點(diǎn)的牙周袋內(nèi), 直至遇輕微阻力為止, 30 s后取出合并放入一個(gè)微離心管中(若有血液和唾液污染,則棄置重取)；再次稱重并按以下公式計(jì)算所取齦溝液的重量：齦溝液重量=(提取齦溝液后3個(gè)濾紙條+ Ep管)的重量- (取樣前3個(gè)濾紙條+ Ep 管)的重量。所有樣本均置于-70 ℃下保存，檢測時(shí)室溫放置1 h后，放入加有0.5 mL PBS緩沖液洗脫離心10 min ( 3 000 r/min), 取上清液；然后按大鼠組胺試劑盒說明檢測各樣本450 nm波長處的吸光度值，并以組胺標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度為X軸，對應(yīng)的450 nm波長吸光度值為Y軸，在CurveExpert 1.4軟件中選擇擬合度最好的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各個(gè)樣品中組胺的濃度。

1.2.4 熒光定量PCR檢測牙齦組織中HR1- mRNA的表達(dá)

齦溝液取樣結(jié)束后，脫頸處死各組大鼠并取其唇頰側(cè)牙齦組織, 吸干血跡和唾液后稱重, 加入三蒸水配制的生理鹽水制成10%組織勻漿；5 ℃、4 000 r/min 離心10 min, 取上清液置-20 ℃凍存待測。取RNAlater中保存的組織樣本，液氮冷凍下研磨后加入Trizol勻漿液裂解細(xì)胞，并嚴(yán)格按照Trizol說明書提取總RNA；分別經(jīng)微量分光光度計(jì)和10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測確定A260/280在1.8～2.0范圍內(nèi)(RNA完整)后，取1 μg RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。然后以稀釋3倍的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，用熒光定量PCR儀測定各樣本中HR1- mRNA表達(dá)情況。所用引物用primer3專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由invitrogen公司合成，各引物序列如下：HR1- mRNA：上游引物5c- GTGGGCATAAGAAACC- 3c；下游引物5c- TCAAGCGGGAAGCAGTAG- 3c，產(chǎn)物長度191 bp；GAPDH： 上游引物5c- TCACCAACTGGGACGACA- 3c，下游引物5c- GCATACAGGGACAGCACA- 3c，產(chǎn)物長度206 bp。

反應(yīng)體系共25 μL，分別為：SYBR Premix EX Taq(TaKaRa公司)12.5 μL、F- primer(10 pmol/lxL)0.5 μL, R- prime(10 pmol/lxL )0.5 μL,cDNA 1 μL，dd H2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，40 cycles。反應(yīng)結(jié)束儀器自動生成循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)后，用HR1- mRNA與內(nèi)參基因GAPDH的Ct值差值(△Ct)表示HR1- mRNA相對含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床大體觀察

建模8周后，對照組牙周組織肉眼觀察無明顯變化，牙周炎組牙周組織有中度炎癥，牙齦紅腫光亮，可探及牙周袋，BOP(+)。

2.2 組織學(xué)觀察

建模8周后組織學(xué)觀察顯示，牙周炎組結(jié)合上皮向根方退縮并形成牙周袋，齦溝上皮變性，上皮及固有層可見中等量炎性細(xì)胞浸潤，牙周膜間隙略增寬；對照組無明顯炎癥反應(yīng)，但牙周膜間隙未見異常；牙齦結(jié)合上皮為無角化的鱗狀上皮,無上皮釘突,牙周膜排列一致；牙槽骨表面光滑,未見破骨細(xì)胞和骨陷窩形成(圖1～2)。

正常對照組 牙周炎組 正常對照組 牙周炎組

圖1 建模8周時(shí)各組牙齦組織形態(tài)(HE, ×100) 圖2 建模8周時(shí)各組牙周組織形態(tài)(HE, ×400)

2.3 各組齦溝液中組胺含量比較

實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，牙周炎組齦溝液中的組胺含量明顯高于正常對照組(P<0.05)(表1)。

2.4 各組牙齦組織中HR1- mRNA含量比較

實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，牙周炎組牙齦組織中的HR1- mRNA含量僅為正常對照組的1/2,兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

表1 各組大鼠齦溝液中組胺含量比較 ±s)

*與對照組相比P<0.05

圖3 各組牙齦組織中HR1- mRNA含量比較

3 討論

組胺可由肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、血小板、樹突狀細(xì)胞以及T細(xì)胞等多種細(xì)胞生成，對機(jī)體的多種生理機(jī)能(包括細(xì)胞的增殖、分化、造血過程、胚胎發(fā)育、組織再生以及傷口愈合等)均有一定的影響。在不同微生物源性感染中，組胺廣泛存在于各種炎癥以及感染性疾病患者的局部組織中，具有正、負(fù)雙向調(diào)控作用細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能[7-13]。在炎癥早期階段,局部組織中可以分離出組胺，表明組胺參與了早期炎癥反應(yīng)，并可促進(jìn)炎癥發(fā)展[14]。組胺的通路活化有賴于其相應(yīng)的4個(gè)受體，按被發(fā)現(xiàn)順序分別命名為：HR1、HR2、HR3、HR4。HRs屬G蛋白偶聯(lián)受體(G- protein-coupled receptors，GPCRs)家族成員，與通過偶聯(lián)激活特異性G蛋白而進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。組胺-HR1通路需在組胺脫羧酶的作用下激活，有研究證實(shí)先天缺乏組胺脫羧酶大鼠的骨組織中破骨細(xì)胞生成減少，并只有少量的破骨細(xì)胞[15]，說明組胺與破骨細(xì)胞的生長以及骨組織損傷關(guān)系密切。不同組胺受體通路的功能由4個(gè)不同的特定組胺受體亞型所介導(dǎo)，其中HR1被認(rèn)為是自身免疫性疾病的關(guān)鍵分子，表達(dá)于Th1細(xì)胞，具有調(diào)控組胺致敏的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠牙周炎模型，并在牙周炎病理?xiàng)l件下檢測了齦溝液中組胺的表達(dá)量。結(jié)果顯示，牙周炎組齦溝液中組胺水平明顯高于正常對照組(P<0.05)；暗示，組胺表達(dá)的升高與牙周病的病程呈正相關(guān)性，并說明在慢性炎癥的刺激中可能持續(xù)存在細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象，從而導(dǎo)致大量組胺的產(chǎn)生，加重了組織對炎癥反應(yīng)的應(yīng)答。

另外，Ma RZ研究發(fā)現(xiàn)，HR1通過依賴IFN- γ分泌增加從而促使Th1細(xì)胞的應(yīng)答，在對組織的破壞損傷作用中扮演重要角色[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組牙齦組織中的HR1- mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)組胺及HR1通路在牙周炎的進(jìn)展中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，一定程度的炎癥條件下，由肥大細(xì)胞合成和分泌的組胺、肝素、類胰蛋白酶、細(xì)胞因子等能夠刺激成纖維細(xì)胞增殖并形成胞外基質(zhì)積聚，從而使組織纖維化[17]。另外，組胺的過度增加還會加重TNF- α、IL- 1、LPS對牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥刺激，并增強(qiáng)局部組織的免疫反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重了牙周組織的破壞[18]。組胺可通過刺激牙齦成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、前列腺素，使IL- 2、IL- 4、PGE2表達(dá)升高[18-19]。其中PGE2是一種炎癥介質(zhì)和強(qiáng)效促進(jìn)骨吸收的刺激因子，能夠加速破骨細(xì)胞的形成、增強(qiáng)破骨細(xì)胞前體的融合、抑制鈣化，從而促進(jìn)骨的吸收[20-21]。組胺參與了機(jī)體大多數(shù)免疫及炎癥的生理、病理反應(yīng)[7]，在免疫功能中起著潛在的調(diào)節(jié)作用[22]。本結(jié)果顯示，牙周炎組齦溝液中組胺的含量明顯增加，而HR1表達(dá)明顯下降，暗示了組胺-HR1通路在牙周炎癥中的重要調(diào)控作用，即當(dāng)炎癥發(fā)展到一定程度時(shí)，HR1的下降使組胺-HR1通路水平下降，并形成負(fù)向調(diào)節(jié)，從而可保護(hù)組織免受炎癥中因組胺的不斷增加而產(chǎn)生的進(jìn)一步破壞。相關(guān)研究也表明，HR2拮抗劑在兔模型中可抑制牙周炎，并能減少骨吸收的形成[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，HR1的活化還可導(dǎo)致氣道及血管平滑肌細(xì)胞的收縮、增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性；并促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞合成前列腺環(huán)素(prostacyclin)以及血小板激活因子(plateletactivating factor)；而HR2通路則主要對血管、子宮以及氣道平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生舒張作用；在一定情況下，可通過激活HR1通路以達(dá)到對HR2通路的雙向調(diào)節(jié)作用[24-25]。

Masahiro等證實(shí)，運(yùn)用HR1拮抗劑可以抑制組胺誘導(dǎo)的集落刺激因子、IL- 6和IL- 8的分泌，并能拮抗組胺介導(dǎo)的Ca2+依賴的NF- kB通路[26]。目前，在炎癥中針對調(diào)控組胺-HR1的治療手段，主要通過HR1拮抗劑的使用而抑制阻礙該通路的激活，從而抑制不斷增多的組胺對炎性組織的進(jìn)一步破壞。但運(yùn)用HR1受體拮抗劑治療炎性以及變態(tài)反應(yīng)性疾病時(shí)，常會因不同病理環(huán)境而使其療效存在一定差異[27]。因此，從基因水平對組胺-HR1的調(diào)控治療可能更具重要意義。本實(shí)驗(yàn)中檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組齦溝液組胺的含量明顯高于正常對照組(P<0.05)；而HR1- mRNA表達(dá)水平則較正常對照組明顯下降 (P<0.05)；提示，在炎癥反應(yīng)條件下活體組織中可能存在調(diào)控HR1基因表達(dá)的重要機(jī)制；從而為組胺-HR1通路控制治療手段提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但HR1在炎癥中通過何種調(diào)控而影響其基因表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入的研究。

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Differential expression of histamine and histamine receptor 1 in rats with periodontitis

FENG Xiao- qian, ZHANG Gang, ZHANG Hui- yu, FENG Xiao- dan, ZHANG Ping, TAN Ying- hui

(ChongQing,DepartmentofStomatology,XingQiaohospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

AIM: To investigate the expression of histamine and histamine receptor 1(HR1) in rat gingival crevicular fluid (GCF) and gingival tissues. METHODS: 40 adult SD rats were randomly divided into 2 groups(n=20): The periodontitis models were established by ligation technique and the rats in control group received no treatment. After 8 weeks, Histamine in GCF was detected by ELISA. HRI mRNA expression in gingival tissues was detected by QT- PCR. RESULTS: The level of histamine in GCF in the periodontitis group (35.47±3.908) μg/L was higher than that in control group (19.77±3.832)μg/L(P<0. 05). HRI mRNA in gingival tissues of periodontitis group was lower than that of the control group (P<0.05). CONCLUSION: Upregulation of histamine in GCF and downregulation of HRI in gingival tissues may play important roles in pathogenesis of periodontitis.

periodontitis; rat; histamine; histamine receptor 1

2014-06-30;

2014-12-09

軍隊(duì)十二五課題(CWS12J096)

馮小倩(1988-), 女, 漢族, 安徽人。碩士生(導(dǎo)師: 譚穎徽)

譚穎徽,E-mail: tanyh1962@outlook.com

R781.4

A

1005-2593(2015)01-0015-05

第三軍醫(yī)大學(xué)校管課題(2011D274)