林怡翔 徐 君 顧若漪 曹銀銀 劉斯達 李爍琳 王慧君，2 黃國英，2

先天性心臟病(CHD)是一種常見的出生缺陷［1］。遺傳與環(huán)境因素被認為對CHD的發(fā)病機制有較大影響［2］。遺傳學研究已證實染色體異常和多個基因突變與CHD存在關(guān)聯(lián)，但其低發(fā)生率和高變異不足以完全解釋CHD的發(fā)病。環(huán)境因素對個體表型的影響及其相關(guān)機制尚未闡明［3，4］。組蛋白修飾與基因表達調(diào)控密切相關(guān)，廣泛參與了轉(zhuǎn)錄的啟動終止、基因表達沉默和染色體重構(gòu)等過程，是表觀遺傳學的重要部分。本課題組前期研究證實法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中組蛋白整體乙酰化水平存在異常，其中組蛋白H3第27位賴氨酸殘基(K27)的乙酰化修飾(H3K27ac)在 CHD患兒中明顯降低［5］。有研究表明，H3K27三甲基化修飾異常能夠影響基因的表觀沉默，從而破壞正?；驎r空表達，導(dǎo)致胎鼠心臟畸形［6］。近年來，研究者逐漸認識到單個位點的修飾無法解釋組蛋白對基因表達影響;位點間的相互作用以及各位點修飾狀態(tài)的組合，是構(gòu)成組蛋白調(diào)控基因表達的主要基礎(chǔ)［7，8］。組蛋白H3K27與其相鄰的第28位點絲氨酸殘基(S28)已被證實具有相互作用;S28的磷酸化(S28ph)狀態(tài)可影響K27位點的修飾狀態(tài)，從而影響基因的表達調(diào)控［8，9］。本研究以C2C12細胞為研究對象，用廣譜的組蛋白去乙?；?HDACs)抑制劑丁酸鈉、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)抑制劑姜黃素及蛋白激酶C(PKC)的強激活物佛波酯［14］干預(yù)細胞，通過Western Blot檢測C2C12細胞組蛋白H3K27的乙酰化和H3S28的磷酸化水平，用RT-PCR檢測干預(yù)后細胞心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達變化，從而探討H3K27和H3S28位點修飾在CHD發(fā)病中的可能機制。

1 方法

1.1 材料 C2C12細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫;高糖DMEM細胞培養(yǎng)基購自美國HyClone公司;胎牛血清及青霉素鏈霉素雙抗購自美國Invitrogen公司;丁酸鈉、姜黃素購自Sigma公司;H3K28ac及H3S28ph抗體購自Cell SignalTechnology公司;β肌動蛋白(內(nèi)參)抗體購自Abcam公司;蛋白酶抑制劑(PIC)及磷酸酶抑制劑(PI)購自美國Roche公司;蛋白定量試劑盒及Western顯影試劑盒購自LifeTechnology公司;30%聚丙烯酰胺凝膠和硝酸纖維薄膜購自美國伯樂公司;RIPA(強)裂解液及Western Blot其他試劑購自上海威奧生物科技有限公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自日本Takara公司;Real-time PCR儀(ABI-7900)為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) C2C12細胞復(fù)蘇后接種于10cm2培養(yǎng)皿，加入含10%FBS及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。胰酶消化處理后傳代;傳代細胞長滿后接種于12孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁生長后進行干預(yù)。

1.3 分組和細胞處理 設(shè)丁酸鈉組、姜黃素組、佛波酯組和對照組。丁酸鈉以超純水溶解，姜黃素、佛波酯溶于DMSO溶劑，并調(diào)整DMSO濃度為1/1000。藥物處理接種于12孔板的細胞:丁酸鈉濃度為50mmol·mL-1，姜黃素濃度為25μmol·mL-1，佛波酯濃度為50nmol·mL-1，均做3復(fù)孔;對照組和丁酸鈉組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。加藥后的細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后收集細胞并用PBS洗滌沉淀，行H3K27ac、H3S28ph和心臟發(fā)育相關(guān)基因表達檢測。

1.4 Western Blot檢測組蛋白H3K27ac與H3S28ph水平在RIPA(強)裂解液中加入0.1%蛋白酶抑制劑及2%磷酸酶抑制劑。取洗滌后細胞沉淀，加入100μL裂解液，充分吹打混勻，置冰裂解。裂解后離心分離沉淀，取上清液用試劑盒定量。定量后蛋白加入5×Loading上樣緩沖液并配制為終濃度1mg·mL-1。制作濃縮膠與分離膠，加入蛋白樣品并加入一個泳道的蛋白分子量Marker;在電泳槽中以130V電壓電泳約70min。切取分離膠轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)膜槽，以0.35mA電流轉(zhuǎn)膜90min，將蛋白及Marker轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。以立春紅染料染硝酸纖維膜，并根據(jù)Marker剪取目標分子量的膜上條帶(組蛋白H325kD，β-肌動蛋白45kD)。洗滌后加入5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原1h。加一抗置4℃冰箱孵育過夜。次日洗滌后加入二抗室溫孵育1h，洗凈二抗。用顯影試劑盒顯影，并用Las3000成像系統(tǒng)曝光拍照。用bandleader軟件進行灰度掃描并計算目的條帶與內(nèi)參的灰度比值。

1.5 細胞總RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法抽提總RNA。在洗滌后的細胞中加入1mLTrizol試劑，吹打混勻后置冰裂解完全。加入氯仿混勻離心，分離水相。加入預(yù)冷異丙醇沉淀RNA并離心，并用75%乙醇洗滌沉淀。沉淀干燥后加入DEPC水溶解沉淀。用紫外分光光度法測定RNA濃度;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量(有3條帶為質(zhì)量良好)。抽提后的總RNA用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.6 引物合成及實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測基因表達 采用IDTdna公司提供的在線Realtime引物設(shè)計軟件，對參與心臟發(fā)育過程的代表基因設(shè)計引物(表1)，擴增片段均跨外顯子，片段長度為100～200 bp。8個候選基因包括心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族(TBX2，GATA4，Sxi1)、信號通路基因(Bmp2，TGFβ2)以及心臟特異性基因(Nkx2.5，cTnT，Cx43)。PCR反應(yīng)體系10μL:RT-PCR 引物1μL、cDNA 2μL(含1μg cDNA)，超純水2μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性120s;PCR循環(huán):95℃5s，60℃30s，擴增40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，采用SDS 2.3軟件輸出結(jié)果。

1.7 丁酸鈉和姜黃素濃度梯度處理細胞 對2種及以上藥物處理基因表達與對照組相比有統(tǒng)計學差異的基因，進一步行藥物濃度梯度處理。在培養(yǎng)細胞中加入不同濃度的丁酸鈉(0、1、10和100mmol·mL-1)及姜黃素(0、0.1、1和10μmol·mL-1)，并調(diào)整DMSO濃度為1/1 000。每個濃度均做3復(fù)孔，加藥后處理1.3項下，行H3K27ac、S28ph水平和心臟發(fā)育相關(guān)基因表達檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 用GraphPad Prism5軟件分析實驗結(jié)果。計量資料以±s表示。RT-PCR結(jié)果及Western灰度掃描結(jié)果采用單因素方差分析，組間差異用Bonferroni法比較。藥物濃度與H3K27ac、S28ph水平和心臟發(fā)育相關(guān)基因表達相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)檢驗，(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab 1The sequences of primers in realtime PCR

2 結(jié)果

2.1 藥物細胞生長情況 加藥后用倒置相差顯微鏡觀察處理細胞。細胞狀況良好，大多貼壁生長，細胞形態(tài)成多角形，細胞核清晰可見。丁酸鈉100mmol·mL-1處理后細胞有部分死亡漂起，貼壁細胞較其他組略少，細胞形態(tài)尚可，無大面積死亡現(xiàn)象。

2.2 藥物處理后細胞整體組蛋白修飾水平變化 圖1顯示，丁酸鈉組H3K27ac水平在4組中最高，姜黃素組H3K27ac水平在4組中最低，丁酸鈉組H3S28ph水平明顯低于其他3組。單因素方差分析顯示，4組間H3K27ac、H3S28ph水平差異總體上有統(tǒng)計學意義((P＜0.001))，Bonferroni檢驗提示丁酸鈉組、姜黃素組、佛波酯組H3K27ac和H3S28ph水平分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義，H3K27ac:(1.90±0.04)、(0.04±0.00)、(1.67±0.00)vs(1.09±0.01)，(P＜0.05);H3S28ph:(0.04±0.01)、(0.97±0.06)、(1.58±0.03)vs(0.73±0.01)，(P＜0.05)。

圖1 4組組蛋白H3K27ac及H3S28ph Western BlotFig 1 Histone H3K27ac and H3S28ph examined by Western blot of 4 groups

2.3 藥物處理后細胞心臟發(fā)育相關(guān)基因表達 RT-PCR結(jié)果顯示(表2)，8個心臟發(fā)育相關(guān)基因表達4組間差異總體上有統(tǒng)計學意義;相較于對照組，丁酸鈉組有表達差異的基因6個(Cx43、cTnT、Nkx2.5、TBX2、Gata4 和Six1)，姜黃素和佛波酯組有表達差異的基因分別為3個(cTnT、Six1、Tgfb2)和 4 個(Bmp2、cTnT、Gata4、Six1)。其中，cTnT基因?qū)τ?種藥物處理產(chǎn)生的表達改變與對照組差異均有統(tǒng)計學意義，丁酸鈉組cTnT表達顯著低于對照組((P＜0.05))，姜黃素與佛波酯組的cTnT表達顯著高于對照組((P＜0.05))。Cx43基因及Six1基因分別對2種藥物處理有明顯表達變化;丁酸鈉組Cx43基因表達較對照組明顯降低((P＜0.05))，佛波酯組Cx43基因表達明顯上升((P＜0.05));姜黃素與佛波酯處理后的Six1基因表達較對照組明顯升高((P＜0.05))，上述3個基因進入后續(xù)藥物濃度梯度分析。

表2 4組心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(±s)Tab 2 Heartdevelopment related genes'expressions after treatments in 4 groups(±s)

表2 4組心臟發(fā)育相關(guān)基因表達(±s)Tab 2 Heartdevelopment related genes'expressions after treatments in 4 groups(±s)

Group Cx43 Bmp2 Gata4Tgfb2 Nkx2.5TBX2 cTnT Six1 Control 1.30±0.44 1.25±0.37 1.32±0.28 1.76±0.79 0.85±0.22 0.94±0.34 1.18±0.140.78±0.14 Sodium butyrate 0.47±0.06 3.26±1.52 2.39±0.19 1.36±0.35 3.62±1.09 14.81±5.30 0.11±0.02 0.46±0.09 Curcumin 1.46±0.12 7.28±2.32 1.76±0.25 5.33±2.15 1.13±0.33 2.26±1.89 2.21±0.45 1.27±0.36 Phorbol ester 2.04±0.77 4.72±1.72 1.89±0.14 2.91±0.46 1.23±0.65 1.25±0.54 2.10±0.35 1.57±0.12 F 75.23 6.889 11.85 6.837 11.19 16.7 33.36 17.02 (P＜0.001) 0.017 0.002 6 0.013 4 0.003 1 0.000 8 ＜0.000 10.000 8

2.4 藥物濃度梯度處理C2C12細胞后組蛋白修飾變化及基因表達的變化 Western Blot結(jié)果顯示，隨著丁酸鈉濃度增加，H3K27ac水平顯著升高，H3S28ph水平明顯降低;姜黃素濃度梯度處理后H3K27ac、H3S28ph水平變化趨勢與丁酸鈉相反(圖2)。cTnT、Cx43及Six1基因表達結(jié)果顯示，cTnT基因表達隨丁酸鈉濃度升高有降低趨勢，隨著姜黃素濃度升高有表達上升的趨勢;Cx43隨丁酸鈉濃度升高表達呈顯著下降趨勢((P＜0.01))，姜黃素濃度升高對其表達影響不明顯;Six1基因隨丁酸鈉濃度升高表達呈降低趨勢，姜黃素濃度升高后表達呈現(xiàn)升高趨勢(表3)。

圖2 丁酸鈉和姜黃素濃度梯度處理H3K27ac及S28ph Western BlotFig 2 Histone H3K27ac and H3S28ph examined by Western blot after sodium butyrate and curcumin treatment

表3 丁酸鈉及姜黃素梯度處理后基因表達變化(±s)Tab 3 Heartdevelopment related genes'expressions after NaB and curcumin ladder(±s)

表3 丁酸鈉及姜黃素梯度處理后基因表達變化(±s)Tab 3 Heartdevelopment related genes'expressions after NaB and curcumin ladder(±s)

cTnT Cx43Six1 Sodium butyrate/mmol·L-1 0 0.65±0.11 0.55±0.18 0.68±0.26 1 0.29±0.03 0.37±0.05 0.40±0.11 10 0.02±0.01 0.06±0.02 0.09±0.03 100 0.01±0.003 0.04±0.02 0.07±0.03 F 82.958 21.88 12.319 (P＜0.001) ＜0.001 ＜0.05 Curcumin/μmol·L-1 0 0.65±0.11 0.36±0.27 0.68±0.26 1 1.04±0.51 0.21±0.23 0.87±0.36 10 1.33±0.37 0.04±0.03 1.19±0.30 100 1.27±0.27 0.03±0.02 1.28±0.27 F 2.315 5.321 2.614 P 0.152 0.0230.123

相關(guān)性分析顯示，組蛋白H3K27ac水平與丁酸鈉濃度的指數(shù)呈正相關(guān)(R2=0.963)，H3S28ph水平與丁酸鈉濃度指數(shù)呈負相關(guān)(R2=0.993);H3K27ac水平與姜黃素濃度指數(shù)呈負相關(guān)(R2=0.966)，H3S28ph與姜黃素濃度指數(shù)呈正相關(guān)(R2=0.930)。

對組蛋白的總體修飾水平與cTnT、Cx43和Six1基因的表達相關(guān)分析顯示，丁酸鈉濃度梯度處理的H3K27ac水平與3個基因表達均呈負相關(guān)(R2分別為0.709、0.713和0.651)，H3S28ph水平與3個基因表達均呈正相關(guān)(R2分別為0.866、0.822和0.766);姜黃素濃度梯度處理的H3K27ac、H3S28ph3水平與3個基因表達均無明顯相關(guān)性(R2均＜0.5)。

3 討論

CHD發(fā)生機制在很大程度上受到非遺傳因素影響。環(huán)境因素是主要的非遺傳致病因素。既往研究證實，宮內(nèi)感染、孕期藥物使用、吸煙、孕婦酗酒、高海拔缺氧等環(huán)境因素與CHD發(fā)病存在關(guān)聯(lián)［2，10～12］。環(huán)境致病因素暴露，伴有心臟基因表達變化和組蛋白乙?；礁淖儯?1，12］。組蛋白修飾在心臟發(fā)育過程中參與了包括基因表達水平調(diào)節(jié)及基因的時序表達等重要過程。組蛋白修飾狀態(tài)與基因表達調(diào)控的因果關(guān)系目前尚無明確結(jié)論。一方面組蛋白的乙?；土姿峄揎椩诨虮磉_過程中處于動態(tài)變化過程［2］，另一方面組蛋白甲基化修飾與表觀沉默機制的深入研究明確了組蛋白修飾是某些特定基因表觀沉默的成因或條件［13］。多項前期研究表明組蛋白修飾水平異常與CHD存在關(guān)聯(lián)［5，6，9，13］。

組蛋白H3K27ac通常被認為是基因激活和表達的標志。近期研究表明，組蛋白H3S28ph修飾影響K27位點的修飾狀態(tài)，人為磷酸化S28能夠使得K27位點三甲基化沉默修飾失效并導(dǎo)致K27磷酸化和沉默基因重新表達［8，14］。有學者提出組蛋白H3K27與S28位點修飾狀態(tài)及其調(diào)控類似細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。研究K27與S28位點的修飾狀態(tài)及其對心臟發(fā)育相關(guān)基因的影響，可以揭示本課題組前期發(fā)現(xiàn)的CHD心肌組織存在的組蛋白乙?；惓Ｒ约霸摻M蛋白通路在CHD發(fā)病中的可能機制。

本研究Western blot結(jié)果顯示，丁酸鈉處理的C2C12細胞H3K27ac水平升高，伴H3S28ph水平的下降;相反，姜黃素組的H3K27ac水平明顯降低，H3S2ph水平明顯提高。佛波酯組顯示H3S28ph顯著升高伴H3K27ac水平升高。既往研究表明磷酸化組蛋白H3S28位點促進K27ac，姜黃素抑制HATs之后，S28ph水平異常升高，提示S28ph可能是反饋性上調(diào)以促進K27ac。目前尚缺乏對K27位點去乙?；瘷C制的研究;本研究結(jié)果顯示丁酸鈉抑制HDACs后，K27位點去乙?；茏?，S28位點磷酸化明顯降低，提示S28ph可能參與K27ac機制。因此，預(yù)測S28磷酸化狀態(tài)可能是組蛋白H3K27S28通路的調(diào)控節(jié)點，S28位點是否發(fā)生磷酸化是決定K27位點是否發(fā)生乙酰化的條件，從而調(diào)節(jié)了基因表達調(diào)控。然而上述結(jié)論是基于總體組蛋白的修飾水平，并未具體到某一個組蛋白H3分子或發(fā)生K27S28位點共同修飾的組蛋白所占的比例，因此無法證實該機制是否存在，需要進一步研究。

丁酸鈉與姜黃素濃度梯度處理后，C2C12細胞的組蛋白修飾狀態(tài)均產(chǎn)生與藥物濃度相關(guān)的變化。相關(guān)性分析表明，H3K27ac、H3S28ph水平與丁酸鈉及姜黃素劑量的指數(shù)在本實驗濃度內(nèi)有很高的相關(guān)性，證實了通過控制丁酸鈉與姜黃素濃度，能夠使得總體組蛋白H3K27乙?；疆a(chǎn)生變化，同時影響其相鄰的S28位點磷酸化作用。

本研究顯示，丁酸鈉組組蛋白高乙?；揎棤顟B(tài)導(dǎo)致了8個被檢測基因中6個發(fā)生了表達改變，姜黃素和佛波酯也分別通過影響組蛋白修飾導(dǎo)致3～4個基因表達改變。提示改變組蛋白H3K27S28整體修飾狀態(tài)，能夠改變心臟相關(guān)基因的表達，這與本課題組前期的研究［5］結(jié)果一致，并提示總體組蛋白修飾狀態(tài)對CHD發(fā)病的影響，可能是通過影響心臟相關(guān)基因的正常表達。在丁酸鈉梯度處理的細胞中，cTnT、Cx43和Six1基因表達與H3K27ac和S28ph存在相關(guān)性，但姜黃素組中未觀察到顯著相關(guān)性，因此無法確定被檢測基因表達與這2個位點的某一修飾狀態(tài)間是否存在相關(guān)性。另外，由于總體組蛋白修飾水平不能等同于某一特定基因上的組蛋白修飾狀態(tài)，也無法確定被檢測基因的確切組蛋白修飾情況，需要更深入的研究。

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