劉靖靖，趙晶，田瑩瑩，陳明，王瑞琦

1(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連，116034)

2(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116600)

鄰苯二甲酸酯(Phthalates，PAEs)是工業(yè)上被廣泛使用的高分子材料助劑，在塑料中加入該物質(zhì)，可增強(qiáng)產(chǎn)品的透明度、柔韌性和可塑性［1－2］。PAEs的分子結(jié)構(gòu)與生物激素類似，痕量的PAEs可通過飲水、呼吸、皮膚接觸等方式進(jìn)入人體，影響人體內(nèi)激素含量，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)［3］。若長(zhǎng)期食用含PAEs的食品會(huì)造成生殖系統(tǒng)異常甚至致癌、致畸的危險(xiǎn)，因此PAEs不能添加在食物中和用于生產(chǎn)食品包裝材料［4－6］。許多國(guó)家已將PAEs列入優(yōu)先監(jiān)測(cè)的黑名單中，例如，美國(guó)國(guó)家環(huán)保署將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)6種PAEs列為優(yōu)先控制污染物［7］，并規(guī)定在飲水中 DEHP 的最大允許濃度為 6 μg/L［8－9］;我國(guó)在水中優(yōu)先控制污染物名單中列入了DMP、DBP和 DEHP［10］;歐盟規(guī)定 DBP、BBP、DEHP 的特定遷移量分別低于0.3、30和1.5 mg/L。

近年來，公眾十分關(guān)注 PAEs導(dǎo)致的食品污染［11－12］，啤酒作為世界上最普遍的酒精飲料，其中PAEs的殘留也是消費(fèi)者健康的安全隱患，因此檢測(cè)和控制啤酒中PAEs含量具有重要意義。然而，目前我國(guó)并沒有專門針對(duì)啤酒中PAEs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)酒類檢測(cè)均采用國(guó)家頒布的食品中PAEs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即GB/T21911－2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測(cè)定》，但有文獻(xiàn)指出該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)酒樣中PAEs的檢測(cè)結(jié)果并不穩(wěn)定、回收率較低［13－14］。同時(shí)針對(duì)啤酒樣品中溶解有CO2氣體以及樣品成分復(fù)雜等特點(diǎn)，會(huì)對(duì)PAEs的測(cè)定結(jié)果造成干擾，并且啤酒樣品在萃取過程中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，造成測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、回收率低，甚至無法檢測(cè)。因此，建立一種干擾性小、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確快速的啤酒中PAEs測(cè)定方法，成為目前亟待解決的問題。

本文采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)測(cè)定啤酒中的PAEs，對(duì)啤酒樣品中干擾因素(溶有CO2、成分復(fù)雜、易乳化)的消除方法進(jìn)行探討，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、加標(biāo)回收率、方法重現(xiàn)性等各項(xiàng)驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行研究，證明方法的可行性，建立了啤酒中PAEs的GC-MS測(cè)定方法。對(duì)市售啤酒中PAEs的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法針對(duì)性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:美國(guó)Perkinelmer Clarus SQ 8T氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀;德國(guó)IKA VORTEX Genius3漩渦振蕩器;德國(guó)SIGMA 3K15臺(tái)式離心機(jī);美國(guó) BRANSON 5510E-DTH臺(tái)式超聲水浴鍋。

試劑:12種塑化劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(色譜純)，上海安普科學(xué)儀器有限公司;正己烷(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司;NaCl(分析純);市售啤酒。

1.2 色譜條件

(1)氣相色譜條件

色譜柱:Elite 5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:280℃;載氣:氦氣(純度≥99.99%);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;分流方式:不分流;柱溫采取程序升溫:60℃維持1 min，以20℃/min升溫至220℃，維持1 min，以5℃/min升溫至280℃，維持8 min。

(2)質(zhì)譜條件

傳輸線溫度:250℃;離子源溫度:250℃;質(zhì)量掃描范圍:40～450 m/z;電離方式EI;電離能量70 eV;溶劑延遲5 min。采用選擇離子掃描(SIM)模式，定性定量離子見表1。

1.3 12種PAEs標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將12種PAEs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用正己烷稀釋至不同質(zhì)量濃度梯度(5、10、20、50、100、200、500 μg/L)，以SIM模式掃描進(jìn)行GC-MS分析測(cè)定。以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以PAEs化合物的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品處理

取混合均勻液體試樣5.0 mL，超聲振蕩5 min以除去CO2及其不穩(wěn)定成分，加入正己烷2 mL，NaCl 1.2 g，漩渦混合2 min，超聲提取15 min，靜置分層，取上清液進(jìn)行GC-MS分析?？瞻讓?duì)照同樣品處理。

表1 12種PAEs的保留時(shí)間和特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions of 12 PAEs

2 結(jié)果與分析

2.1 定性測(cè)定

12種PAEs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、啤酒樣品按實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，GC/MS選擇離子流圖譜如圖1、圖2所示。

圖1 12種PAEs標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子色譜圖(質(zhì)量濃度為100 μg/L)Fig.1 Extracted ion chromatograph profile for twelve PAEs standards at 100 μg/L

圖2 啤酒樣品的選擇離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograph profile for a beer sample

對(duì)比兩圖可知，啤酒樣品與PAEs標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子色譜峰保留時(shí)間一致，峰形尖銳對(duì)稱，進(jìn)一步對(duì)質(zhì)譜圖驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)品一致，且其相對(duì)豐度在允許偏差之內(nèi)。說明定性分析可靠，即可用于判斷啤酒樣品中是否存在該種PAEs。

2.2 定量分析

將配制好的7個(gè)濃度梯度的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定條件下測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以定量離子峰面積Y對(duì)濃度X進(jìn)行線性回歸，其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、方法檢出限如表2所示。結(jié)果表明，12種PAEs回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.995 6以上，線性良好，滿足測(cè)定要求。根據(jù)空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定信噪比(S/N)，以S/N=3時(shí)的濃度為檢出限，其值均小于0.4 μg/L;以S/N=10時(shí)的濃度作為定量限，其值均小于4 μg/L，說明此線性范圍(5～500 μg/L)的最低質(zhì)量濃度高于定量限，故在線性范圍內(nèi)，物質(zhì)的定量準(zhǔn)確。

表2 12種PAEs標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、精密度Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r2)，RSD for twelve PAEs standards

2.3 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

采用GC/MS方法測(cè)定啤酒樣品中的PAEs，針對(duì)樣品中的干擾因素(溶有CO2、成分復(fù)雜、易乳化)，優(yōu)化了啤酒中PAEs測(cè)定的樣品處理?xiàng)l件，旨在建立萃取效率高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便的PAEs測(cè)定方法。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，主要從超聲處理時(shí)間和破乳方法選擇兩方面進(jìn)行優(yōu)化，為了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每種方法均做了3個(gè)平行的加標(biāo)試驗(yàn)(加標(biāo)質(zhì)量濃度為50 μg/L)，以加標(biāo)回收率作為樣品處理?xiàng)l件的衡量指標(biāo)。

2.3.1 不同破乳方法的選擇

啤酒樣品進(jìn)行溶劑萃取時(shí)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致后續(xù)操作無法進(jìn)行，為解決這一難題，本文通過對(duì)比不同消除乳化方法，比較不同方法下PAEs測(cè)定效果，以找到快速、有效的破乳方法。

取啤酒樣品，加正己烷萃取，發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，參照國(guó)標(biāo)GB/T 21911－2008，經(jīng)4 000 r/min離心5 min后仍有嚴(yán)重凝固現(xiàn)象，而國(guó)標(biāo)中對(duì)食品乳化現(xiàn)象這一難題的處理也只行至離心為止［15］，無法滿足啤酒樣品的后續(xù)檢測(cè)要求。本文在樣品萃取過程中，分別采用以下方法進(jìn)行破乳:①靜置分層;②加入NaCl 1.2 g;③超聲15 min;④加入1.2 g NaCl并進(jìn)行超聲15 min;⑤3 000 r/min離心10 min。檢測(cè)結(jié)果以響應(yīng)值、加標(biāo)回收率表示，不同破乳方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響如表3和圖3所示。

對(duì)比不同破乳方法發(fā)現(xiàn)，1.從乳化分層時(shí)間來分析:(1)靜置2 h，難以分層;(2)樣品中加入NaCl，1 h后僅少量分層;(3)超聲15 min或加入NaCl并超聲15 min，明顯分層，以后者分層效果為佳;(4)離心10 min，明顯分層，但分界處有凝固現(xiàn)象。2.從平均響應(yīng)值來分析:方法②③⑤的響應(yīng)值均低于方法④的響應(yīng)值。3.從平均回收率來分析:加入NaCl的加標(biāo)回收率過低，均小于78%;超聲或離心處理可提高加標(biāo)回收率，但仍有部分PAEs的回收率低于70%;加入NaCl并超聲處理的加標(biāo)回收率達(dá)86.33%～99.55%，大大提高了加標(biāo)回收率。加入NaCl可以降低有機(jī)物和萃取溶劑在水相中的溶解度，有利于萃取效率的提高，并且在超聲協(xié)助萃取條件下，實(shí)現(xiàn)了水相與有機(jī)相的破乳快速分層，萃取效率大幅度提高。故選擇加入NaCl并超聲處理作為最優(yōu)的破乳方法。

表3 不同破乳方法的平均回收率Table 3 The average recovery yields of different eliminating emulsification methods

圖3 不同破乳方法對(duì)PAEs標(biāo)準(zhǔn)品平均響應(yīng)值的影響Fig.3 Effects of different eliminating emulsification methods on average response values of PAEs at 50 μg/L

2.3.2 超聲處理時(shí)間的優(yōu)化

針對(duì)啤酒樣品中溶有大量CO2、成分復(fù)雜等特點(diǎn)，先對(duì)樣品分別進(jìn)行 0、5、10、20、30 min 的超聲處理，然后進(jìn)行萃取和GC-MS測(cè)定。以響應(yīng)值為指標(biāo)，對(duì)不同處理時(shí)間的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析(以DBP為例)，結(jié)果見表4;以回收率為指標(biāo)，考察不同處理時(shí)間對(duì)結(jié)果可靠性和重現(xiàn)性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲處理時(shí)間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of the ultrasonisation time

從響應(yīng)值顯著性分析可看出:超聲處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響，說明了超聲處理的必要性。超聲0 min 與超聲5、10、20、30 min 具有顯著性差異，而超聲5、10、20 min之間無顯著性差異，選擇5 min作為最優(yōu)超聲處理時(shí)間。

表4 超聲處理對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性分析(以DBP為例)Table 4 The significance analysis for the effect of ultrasonic treatment on the response value(for DBP)

從平均回收率分析，不進(jìn)行超聲處理(即0 min)的回收率明顯低于超聲處理的結(jié)果，而超聲處理5、10、20、30 min的回收率分別為 89.70%、87.14%、94.45%、103.13%，即均在87%～103.2%之間。這可能是因?yàn)槌曁幚砜梢猿テ【茦悠分腥芙獾腃O2，減少了氣體的干擾;同時(shí)可以促進(jìn)乙醇的揮發(fā)，減少乙醇對(duì)PAEs的溶解，提高了萃取率;還可以除去一些不穩(wěn)定成分，降低在后續(xù)萃取過程中乳化程度以及對(duì)PAEs測(cè)定結(jié)果的影響。綜上分析，超聲時(shí)間在0～30 min范圍內(nèi)，隨超聲時(shí)間的增加，響應(yīng)值增強(qiáng)，超聲處理5 min以上，可保證其回收率為87% ～103.2%，即隨著超聲時(shí)間的增加，響應(yīng)值、回收率總體呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，因此，為節(jié)約時(shí)間，選用5 min作為超聲處理時(shí)間。

2.4 分析方法的回收率和精密度驗(yàn)證

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，采用最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)啤酒樣品進(jìn)行25、50、125 μg/L三個(gè)不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每一水平分別做6個(gè)平行，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差?？瞻讓?shí)驗(yàn)除不加標(biāo)準(zhǔn)樣品外，其余測(cè)定步驟均相同。采用外標(biāo)法定量，結(jié)果如表5所示。

表5 不同加標(biāo)濃度的加標(biāo)回收率及RSDs(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations of different standard concentration(n=6)

結(jié)果表明，樣品中 PAEs加標(biāo)的回收率在88.21%～110.11%，RSD在0.40%～5.49%(均小于10%)，表明該方法回收率好，精密度高。

2.5 市售啤酒樣品的檢測(cè)

將上述建立的方法應(yīng)用于市售啤酒中PAEs含量測(cè)定，共測(cè)定 20種啤酒樣品，其中共檢出DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP 這 5 種 PAEs，其分布情況如表6所示。

表6 啤酒中PAEs類物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 單位:μg/LTable 6 Determination results of phthalates in beer

從表6可以看出，市售啤酒中 DMP、DBP、DEP、DIBP、DEHP的檢出率分別為10%、5%、20%、95%、55%，但檢出的PAEs含量并不高，質(zhì)量濃度在0.77～12.18 μg/L。其中 DEHP 含量為 7.37 ±0.61 μg/L，略高于美國(guó)環(huán)保局規(guī)定的飲水中DEHP的最大允許濃度6 μg/L，但低于歐洲食品安全局規(guī)定的每日允許攝入量的最大劑量0.05 mg/kg(體重)的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究建立了利用GC-MS同時(shí)測(cè)定啤酒中12種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的方法，與我國(guó)頒布的食品中PAEs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比較，本方法創(chuàng)新點(diǎn)如下:(1)針對(duì)啤酒樣品采取超聲處理，不僅可以除去啤酒中溶解的CO2，還可消除樣品中不穩(wěn)定成分對(duì)測(cè)定的干擾，從而避免了復(fù)雜成分引起的誤差，提高了萃取效率及檢測(cè)準(zhǔn)確度;(2)萃取過程中加入NaCl并超聲處理的方法有效解決了乳化難題，分層效果更好，萃取效率大幅度提高。精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入NaCl與超聲萃取并用方法的可行性。通過加標(biāo)回收率的驗(yàn)證和對(duì)市售啤酒樣品的檢測(cè)，證明了該方法具有靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。

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