馮穎，趙琳娜

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

無梗五加(Acanthopanax sessiliflorum)又名五加皮、刺拐棒等，為五加科Araliaceae五加屬多年生藥膳兩用植物［1］，通常山地野生，分布在東北、河北、朝鮮等地［2－3］。

近年來，多種研究表明，人體疑難疾病的發(fā)生機理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或機體清除自由基能力下降有著極為密切的關系［4］，因此，從植物中提取天然的抗氧化物質(zhì)和開發(fā)具有抗氧化功能的食品越來越受到廣泛的關注和重視。

無梗五加果富含黃酮、多糖、花色苷等多種抗氧化物質(zhì)［5－6］，作為抗氧化食品開發(fā)具有巨大的潛力。目前關于其抗氧化物質(zhì)的提取研究報道主要是針對其中的某一類成分，對其總抗氧化物質(zhì)提取的系統(tǒng)研究報道較少［7－8］，本研究以丹東農(nóng)業(yè)科學院提供的無梗五加果作為原料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法分析，以無梗五加果提取液總抗氧化能力為響應值，對其總抗氧化物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無梗五加果:人工栽培品種，由遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學院提供。

無水乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司;T-AOC試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

7200型可見分光光度計，尤尼克(上海)有限公司;電子天平，上海精密科學儀器廠;UV-1600型紫外可見光分光光度計，北京瑞利分析儀器公司;超聲波反應器(KQ-250A型)，昆山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;TDL-5000B型離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 無梗五加果中抗氧化物質(zhì)的提取工藝

無梗五加干燥果實→粉粹過40目篩→超聲提取→離心→定容至100 mL→總抗氧化能力測定

1.2.2 單因素試驗

以無梗五加干燥果為原料，以樣品的總抗氧化能力為考察對象，分別以提取劑、料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率5個因素進行單因素試驗，考察各因素對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.1 提取劑的選擇

料液比1∶50(g∶mL)，提取溫度 50℃，提取時間30 min，功率為250 W條件下考察提取劑為蒸餾水以及乙醇體積分數(shù)分別為10%、30%、50%、70%時對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.2 料液比的選擇

蒸餾水為提取溶劑，提取溫度50℃，提取時間30 min，超聲功率250 W條件下考察料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 時對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.3 提取溫度的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60，提取時間30 min，超聲功率250 W條件下考察提取溫度分別為 30、40、50、60、70℃ 時對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.4 提取時間的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60、提取溫度60℃，超聲功率250 W條件下考察提取時間分別為15、30、45、60、75 min 時對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.5 超聲功率的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60、提取溫度60℃，提取時間為30 min條件下考察超聲功率分別為 150、175、200、225、250 W 時對提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.3 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗所得的結果，以無梗五加果提取液總抗氧化能力為響應值，對超聲波提取無梗五加果中抗氧化物質(zhì)影響較大的3個因素提取溫度、提取時間、超聲功率進行三因素三水平的試驗設計。利用Design Expert8.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，采用Box-Behnken響應面分析得到回歸模型和優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1.2.4 總抗氧化能力(TAC)測定

分別取等濃度和等體積的各樣品液，按TAC測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定各樣品液TAC。定義為在37℃時，每min每mL各樣品液使反應體系的吸光度(OD)值增加0.01為1個TAC單位(u)，即表示為u/mL。取樣及測定均重復3次，取平均值記錄結果。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取劑對提取液的總抗氧化能力的影響

提取劑對提取液總抗氧化能力的影響見圖1。

圖1 提取劑對提取液總抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of extractant on total antioxidant capacity

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，提取液總抗氧化能力逐漸下降，蒸餾水提取所得提取液抗氧化能力最強，說明無梗五加果中的大部分抗氧化物質(zhì)具有水溶性，故以水作為無梗五加果中抗氧化物質(zhì)的提取劑進行后續(xù)實驗。

2.1.2 料液比對提取液的總抗氧化能力的影響

料液比對提取液總抗氧化能力的影響結果如圖2所示。

圖2 料液比對提取液總抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on total antioxidant capacity

從圖2可以看出，隨著提取劑用量的增加，所得提取液的總抗氧化能力也在逐漸增加，當料液比為1∶60(g∶mL)時，總抗氧化能力達到最大，料液比繼續(xù)增大，提取液抗氧化能力略有下降。

2.1.3 提取溫度對提取液的總抗氧化能力的影響

提取溫度對提取液總抗氧化能力的影響結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對提取液總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total antioxidant capacity

從圖3可以看出，提取液總抗氧化能力隨著提取溫度的升高而逐漸增加，當提取溫度達到60℃時，總抗氧化能力達到最高值，溫度繼續(xù)增加，總抗氧化能力變化不明顯。

2.1.4 提取時間對提取液總抗氧化能力的影響

提取時間對提取液總抗氧化能力的影響結果如圖4所示。

圖4 提取時間對提取液總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of extraction time on total antioxidant capacity

從圖4可以看出，隨著提取時間的增加，提取液總抗氧化能力增加，在30 min時達到最大值，提取時間繼續(xù)增加，抗氧化物質(zhì)在超聲波的作用下被破壞分解，提取液總抗氧化能力反而逐漸下降，所以選擇提取時間30 min最佳。

2.1.5 超聲功率對提取液的總抗氧化能力的影響

提取功率對提取液總抗氧化能力的影響結果如圖5所示。

圖5 超聲功率對提取液總抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on total antioxidant capacity

從圖5可以看出，隨著超聲波功率的提高，總抗氧化能力隨之逐漸增加，當功率為225 W時提取液總抗氧化能力出現(xiàn)峰值，功率繼續(xù)提高，總抗氧化能力下降。原因可能是功率加大導致提取物中活性成分分解以至于抗氧化能力下降，所以提取功率選擇225 W最佳。

2.2 響應面試驗設計優(yōu)化工藝參數(shù)

2.2.1 試驗因素和水平的選擇

綜合上述單因素試驗結果，以無梗五加果提取液總抗氧化能力為響應值，選取對超聲波提取無梗五加果中抗氧化物質(zhì)影響較大的三個因素提取溫度、提取時間、超聲功率進行三因素三水平的試驗設計。試驗因素和水平見表1。

2.2.2 響應面分析設計及結果

根據(jù)Design Expert8.0軟件對實驗進行安排，試驗結果分析見表2、表3。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表2 響應面分析方案及試驗結果Table 2 Program and experimental results of RSA

表3 總抗氧化能力回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation for the yield of total antioxidant capacity

對響應值以及各因素進行擬合，得到關于總抗氧化能力的回歸方程如下:

變量模型P＜0.01，達到極顯著水平，回歸方程失擬檢驗P＞0.05，差異不顯著，說明所得的回歸方程擬合程度良好。表3方差分析結果表明方程的一次項提取時間(X2)對響應值總抗氧化能力的影響極顯著，超聲功率(X3)對響應值的影響顯著;交互項X2X3對響應值的影響極顯著，X1X2對響應值的影響顯著;二次項X12、X22、X32對響應值的影響極顯著，由此可知，各具體試驗因素對響應值的影響并非是簡單的線性關系。

2.2.3 響應面曲面直觀分析

圖6 提取溫度和提取時間交互作用對總抗氧化能力的影響Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and time on total antioxidant capacity

圖7 提取時間和超聲功率交互作用對總抗氧化能力的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of time and power on total antioxidant capacity

從圖6可以看出，提取溫度對提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢受提取時間的交互作用的影響。當提取時間較大時，提取液總抗氧化能力偏低且隨著提取溫度的升高先增加后下降的趨勢更加明顯。

從圖7可以看出，提取時間對提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢受超聲功率的交互作用的影響。在所考察的功率范圍內(nèi)，當超聲功率較大時，總抗氧化能力隨提取時間的增加先逐漸增大后減小，當超聲功率較小時，總抗氧化能力隨提取時間的增加而逐漸下降。

從圖8可以看出，提取溫度對提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢不受超聲功率的交互作用的影響。在所考察功率范圍內(nèi)，提取液總抗氧化能力均呈現(xiàn)先增加后下降的相同趨勢。

2.2.4 響應面試驗模型的驗證

通過回歸方程可以得到最優(yōu)的預測值，即提取溫度60.84℃，提取時間27.65 min，超聲功率226.88 W，此時總抗氧化能力的理論值可達88.440 9 u/mL。結合實際操作，優(yōu)化工藝參數(shù)，即提取溫度61℃，提取時間28 min，超聲功率227 W。并對最佳條件做了3次重復試驗進行驗證，平均總抗氧化能力為(88.257 2±0.342 3)u/mL，所得參數(shù)較為可靠。

圖8 提取溫度和超聲功率交互作用對總抗氧化能力的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and power on total antioxidant capacity

3 結論

(1)在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化了各參數(shù)，并結合實際操作選擇了無梗五加果抗氧化活性物質(zhì)提取的最優(yōu)工藝條件:提取溫度61℃，提取時間28 min，超聲功率227 W。并對最佳條件做了3次重復試驗進行驗證，平均總抗氧化能力為(88.257 2±0.342 3)u/mL，說明響應面試驗設計分析能較準確地對提取抗氧化物質(zhì)的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

(2)由試驗數(shù)據(jù)表明，對總抗氧化能力影響最大的因素是提取時間，其次是超聲功率，影響最小的是提取溫度。提取時間和超聲功率交互作用對總抗氧化物質(zhì)的提取效果影響極顯著，提取溫度和提取時間交互作用對總抗氧化物質(zhì)的提取效果影響顯著。

［1］劉鳳華.短梗五加的利用價值及市場開發(fā)前景［J］.生物學通報，2007，4(6):14.

［2］郭麗娜，吳立軍，郭祥菊.無梗五加莖葉化學成分的研究［J］.中草藥，2006，37(6):833－834.

［3］楊坡，孫寶俊，劉娥.短梗五加食用價值及開發(fā)利用［J］.中國野生植物資源，2006，25(2):43－44.

［4］薛明，江漢卿.甘西鼠尾草二萜酮類及有關中草藥單體對超氧自由基的作用［J］.中國獸醫(yī)醫(yī)藥，1999，18(4):13－16.

［5］馮穎，王建國，孟憲軍，等.大孔樹脂純化無梗五加果總黃酮工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34(10):2 169－2 171.

［6］鄧曉宇.短梗五加種子中黃酮類化合物的研究［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學，2009.

［7］王晶晶，馮穎，孟憲軍，等.無梗五加果實多糖抗氧化活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，7(31):15 405－15 406，15 409.

［8］王莉飛，侯微，孟慶福，等.無梗五加果肉及其葉清除DPPH自由基能力初探［J］.特產(chǎn)研究，2010，32(2):40－42.