操 然

（福建農(nóng)林大學(xué) 材料工程學(xué)院，福建 福州350002）

燕窩是金絲燕屬（Collocalia）雨燕科（Apodidae）6 種燕子以其富含蛋白質(zhì)的唾液和羽絨混合凝結(jié)于懸崖峭壁上，或農(nóng)家屋舍而長(zhǎng)成的巢窩。燕窩的種類(lèi)可以隨燕子和筑巢用材分為官燕、毛燕和草燕3種。其中官燕習(xí)慣以純唾液筑成燕巢, 所以雜質(zhì)較少,其色澤微黃,呈絲瓜絡(luò)樣,加水后變軟,吸水力強(qiáng),是燕窩中的上品；毛燕產(chǎn)自“洞燕”,此類(lèi)燕子習(xí)慣用羽毛混和唾液筑巢,毛燕的吸水力較官燕弱,且顏色較暗,含有雜質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較官燕低；草燕喜以雜草混和口水筑巢,含大量雜質(zhì),其燕窩成分是最少的。

燕窩的主要成分為活性糖蛋白和天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)，其特征成分為唾液酸糖蛋白，唾液酸糖蛋白由唾液酸、氨基酸和糖構(gòu)成，在一定的酸性條件下可水解出游離的唾液酸單體，學(xué)名N-乙酰神經(jīng)氨酸。鑒別燕窩的本質(zhì)就是檢測(cè)燕窩中的唾液酸是否具符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 唾液酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 釋放唾液酸

在合理的條件下將唾液酸從低聚糖和糖蛋白中釋放出來(lái)是檢測(cè)燕窩唾液酸含量的前提，常見(jiàn)釋放唾液酸的方法有酸解法和酶解法。其中酸解法大多用磷酸為利用酸水解斷開(kāi)連接、去乙?；?、去碳酸基，唾液酸釋放較為徹底，而且適應(yīng)性好，無(wú)特異性，合適的水解條件是決定唾液酸是否釋放完全的關(guān)鍵。檢測(cè)中所用到的酸有磷酸、冰乙酸、硫酸氫鈉、鹽酸、三氟乙酸（沸點(diǎn)低，提取后易揮發(fā)）、乙酸。所用最多的是硫酸氫鈉和磷酸，酶解法利用較少。

2 唾液酸檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

長(zhǎng)期以來(lái)，經(jīng)過(guò)科技人員的不懈努力，燕窩唾液酸檢測(cè)方法不斷取得進(jìn)展，先后發(fā)現(xiàn)了氣相色譜法、傅里葉紅外光譜法、液相色譜法、紫外分光度計(jì)法、雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)檢測(cè)方法、離子色譜法等6 大類(lèi)9 種方法。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是將唾液酸通過(guò)醇解和三甲基硅烷衍生化后利用氣象色譜儀進(jìn)行分析。在實(shí)踐中，該方法由早期的毛細(xì)管氣象色譜法演進(jìn)到多糖氣相色譜法。

2.1.1 毛細(xì)管氣象色譜法

陳文銳[1]早在1995年就毛細(xì)管法測(cè)唾液酸進(jìn)行了研究。毛細(xì)管法是將燕窩中唾液酸水解后，通過(guò)比對(duì)氨基酸含量，判別燕窩的含量。該研究中對(duì)真燕窩唾液酸水解后和豬皮魚(yú)鰾等摻假燕窩水解后，對(duì)唾液酸中氨基酸種類(lèi)成分進(jìn)行了比較，得出的結(jié)果為真燕窩中16 種氨基酸的總含量為40.50-45.12%； 而豬皮摻假燕窩為73.46%； 魚(yú)鰾為91.80%；銀耳為4.88%；瓊脂為1.37%。并根據(jù)這些差別鑒定了市面宣稱(chēng)含燕窩的飲品，例如“冰糖燕窩”等，通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法和理論分析其是否含羥基脯氨酸和是否含動(dòng)物性蛋白，檢測(cè)出燕窩相關(guān)產(chǎn)品的真?zhèn)?。該方法能粗略檢測(cè)出燕窩中唾液酸，但不能定量測(cè)出唾液酸含量，僅能根據(jù)水解后氨基酸種類(lèi)和含量判斷燕窩加工產(chǎn)品中是否含有燕窩，適用于燕窩相關(guān)產(chǎn)品檢測(cè)。

2.1.2 多糖氣相色譜法

2011年李波[2]等進(jìn)行了氣相色譜法同時(shí)測(cè)定多糖中的中性糖、糖醛酸、氨基糖和唾液酸的研究。用1mol/l 鹽酸甲醇在85℃反應(yīng)18-24h，碳酸銀中和，加入乙酸酐室溫暗處反應(yīng)24h，使氨基糖重新引N-乙?；?，除銀鹽，干燥，加入硅烷化試劑，室溫放置5天，最后用氣相色譜進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所用的多糖樣品為豆腐渣堿溶性多糖和雞腿菇多糖。氣相色譜法測(cè)唾液酸可應(yīng)用至燕窩中唾液酸的檢測(cè)中，與液相色譜等方法相比，該方法樣品用量少，靈敏度高，分辨率強(qiáng)，分析速度快，但也存在前處理時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

2.2 傅里葉紅外光譜法

孫素琴[3]等人在2001 首次利用微鉆石ATR 探頭傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)無(wú)損快速鑒別了6種燕窩。研究根據(jù)燕窩中的唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸)在紅外光譜下有特殊的吸收峰，利用微鉆石ATR探頭FTIR 光譜法直接測(cè)定燕窩樣品，通過(guò)比較不同天然燕窩的紅外特征譜可以達(dá)到鑒別燕窩的作用。研究中對(duì)比了6 種來(lái)源不同的燕窩的紅外吸收光譜，進(jìn)行了非均勻性分析，并對(duì)比了常見(jiàn)燕窩摻假品豬皮屑、銀耳的光譜圖，發(fā)現(xiàn)豬皮屑和銀耳的紅外光譜有較大的特征性, 天然燕窩在2925cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度較弱，而銀耳和豬皮屑則在此處吸收較強(qiáng)；豬皮屑的蛋白質(zhì)、氨基酸類(lèi)化合物含量較豐富,即酰胺Ⅰ、Ⅱ帶(1629、1531cm-1)的吸收峰較強(qiáng)，1039cm-1附近的吸收峰較弱; 銀耳和豬皮屑在1734cm-1附近會(huì)出現(xiàn)脂肪類(lèi)化合物的特征吸收峰，銀耳在1021cm-1的吸收峰很強(qiáng)，這是區(qū)別燕窩中是否摻有豬皮屑和銀耳的判別依據(jù)。

傅里葉紅外光譜法與傳統(tǒng)鑒別方法相比更直觀、可靠，可做到無(wú)損快速鑒別，缺點(diǎn)是不能定量檢測(cè)燕中唾液酸，即N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量。

2.3 液相色譜法

液相色譜法是檢測(cè)唾液酸最常見(jiàn)的方法，主要是將唾液酸在弱酸性條件下水解，從寡糖鏈、糖脂、糖蛋白中游離出來(lái)，利用高效液相色譜法（HPLC）分離，以其他改進(jìn)或衍生的方法來(lái)鑒定。

2.3.1 高效液相色譜法(HPLC)

該方法利用唾液酸在酸性條件下可與某些物質(zhì)（如鄰苯二胺）反應(yīng),生成有強(qiáng)紫外吸收的唾液酸衍生物。具體方法是確定高效液相色譜、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定檢測(cè)波長(zhǎng)、實(shí)際樣品測(cè)定、HPLC 分析（通過(guò)測(cè)定處理后的燕窩樣品吸收峰的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以計(jì)算出其中含唾液酸的含量）。該方法的圖譜具有較強(qiáng)的特征性、直觀性和一致性,能夠鑒別燕窩類(lèi)保健品的真?zhèn)? 還能對(duì)燕窩類(lèi)保健品中的唾液酸含量進(jìn)行定量測(cè)定，具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn),可準(zhǔn)確測(cè)定燕窩及其類(lèi)保健品中唾液酸的含量。

2.3.2 柱前衍生二極管陣列/熒光檢測(cè)器串聯(lián)的反相高效液相色譜檢測(cè)法 (DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法)

馮婷玉[4]等人在2009年對(duì)HPLC 進(jìn)行改進(jìn)，該方法采用DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法，以鄰苯二氨鹽酸鹽(OPD-HCl)為衍生化試劑對(duì)唾液酸(N—乙酰神經(jīng)氨酸)進(jìn)行定量測(cè)定。通過(guò)對(duì)比不同屬解條件，該方法選擇了0.5mol/l 硫氫酸鈉在80℃水浴加熱30 分鐘的水解方法，唾液酸在酸性條件下與鄰苯二胺反應(yīng)生成強(qiáng)紫外吸收和熒光的唾液酸衍生物，采用C18 柱分離，四氫呋喃溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，檢出限為0.2μg/mL(DAD)，0.005μg/mL(FLD)。

DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法將最普及的HPLC 檢測(cè)器DAD 和具有更高的靈敏度和選擇性的FLD 串聯(lián)，彌補(bǔ)各自的不足，保證待測(cè)唾液酸在各濃度下能被正確檢出。該法具有靈敏度高、檢出限低、定量準(zhǔn)確、方便快速等特點(diǎn)。

2.3.3 高效液相色譜—質(zhì)譜法(HPLC-MS)

侯向昶[5]等人在2013年建立了燕窩中唾液酸含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定方法。該方法將經(jīng)磷酸水解后的燕窩中的唾液酸從與唾液酸糖蛋白的結(jié)合狀態(tài)中游離出來(lái)，吸取上清液過(guò)Oasis HLB 柱，用水淋洗固相萃取柱并棄去全部流出液，用真空泵在40-60kPa 負(fù)壓下抽干Oasis HLB 固相萃取柱，再用甲醇洗脫被測(cè)物，洗脫液40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相溶液定容，采用負(fù)離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，并用外標(biāo)法計(jì)算其唾液酸含量。方法的線性范圍在0.1-50mg/L 之間，相關(guān)系數(shù)0.999，檢出限為0.02mg/kg，定量限為0.1mg/kg，樣品平均加標(biāo)回收率為93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.52%。與其他高效液相色譜法不同的是，該方法省略了唾液酸衍生化的過(guò)程，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，同時(shí)在流動(dòng)相中采用高比例水相并采用T3 色譜柱，解決了極性化合物唾液酸在C18 柱上不保留或者需要通過(guò)衍生化的方式進(jìn)行測(cè)定的問(wèn)題。

高效液相色譜—質(zhì)譜法前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、靈敏度高，可應(yīng)用于燕窩中唾液酸含量的測(cè)定。

2.4 紫外分光光度計(jì)法（UV-Vis）

李敏[6]等人在2011年研究了用分光光度計(jì)方法檢測(cè)燕窩含量。實(shí)驗(yàn)研究了水解時(shí)酸的種類(lèi)、酸的濃度和時(shí)間對(duì)水解的影響。并得出了最適宜的水解條件為50%的醋酸水解10min。該方法利用唾液酸與酸性茚三酮形成穩(wěn)定的黃色物質(zhì)，在470nm 有最大吸收峰的特點(diǎn)，用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出唾液酸含量。該方法準(zhǔn)確率高，可定量檢測(cè)唾液酸含量、定量鑒別燕窩真?zhèn)?。該方法比HPLC 法結(jié)果偏低，但無(wú)顯著性差異。

2.5 雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法（ELISA）

張世偉[7]等人在2013年建立一種燕窩中唾液酸糖蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。該方法以唾液酸糖蛋白為抗原, 分別制備唾液酸糖蛋白的多克隆和單克隆抗體。將單克隆抗體為包被抗體, 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體為二抗構(gòu)建燕窩唾液酸糖蛋白的雙抗夾心ELISA 方法。本方法的IC50為2.3ng/mL，樣品的添加回收率為92%-96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法僅將唾液酸作為檢測(cè)目標(biāo)，但目前唾液酸已能進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，作為食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用，并不是燕窩特有的組分。將唾液酸法作為燕窩制品真?zhèn)舞b定的方法，其特異性及可靠程度不高。但該方法利用燕窩中唾液酸主要以唾液酸糖蛋白形式高豐度、特異性存在的，唾液酸蛋白在不同燕窩中含量穩(wěn)定且不易熱變性、熱分解，可作為燕窩的指示蛋白。摻偽燕窩由于混入了其他物質(zhì)，其唾液酸糖蛋白含量將明顯偏低。該方法檢測(cè)實(shí)際樣品穩(wěn)定可靠，能檢測(cè)燕窩中的唾液酸為燕窩所特有而不是另外添加的。

雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法不易受基質(zhì)干擾，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)成商品化試劑盒的潛力。該方法具有高靈敏度和高特異性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。能同時(shí)對(duì)幾十個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，可用于生產(chǎn)實(shí)際中[8]。

2.6 離子色譜法—積分脈沖安培法

李耿[9]等在2014 采用離子色譜儀、抑制器、電導(dǎo)檢測(cè)器在一定條件下分別測(cè)定燕窩、速食燕窩及偽品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果N-乙酰神經(jīng)氨酸在0.25-5.00μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，r=0.9999； 在燕窩中的平均回收率為99.7%，RSD=0.82%（n=6）。該方法的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，可達(dá)pmol 水平；分析時(shí)間短，一般在15-30min 內(nèi)即可完成；無(wú)需進(jìn)行衍生化和嚴(yán)格的樣品處理；可以使用梯度洗脫；色譜柱的選擇性及分辨率高；可定性定量檢測(cè)燕窩及其相關(guān)產(chǎn)品中唾液酸含量。

3 總 結(jié)

至今為止，科技工作者發(fā)現(xiàn)了6 大類(lèi)9 種燕窩唾液酸檢測(cè)方法，各有特點(diǎn)，現(xiàn)綜合比較如表1 所示。

表1

續(xù)表

對(duì)比以上6 大類(lèi)燕窩鑒別方法，氣相色譜法、紅外光譜法等方法可粗略檢測(cè)燕窩中的唾液酸，但不能定量檢測(cè)出唾液酸的含量，可用于判斷加工產(chǎn)品中是否含有燕窩。液相色譜法和紫外分光光度計(jì)法和離子色譜—積分脈沖安培法均可以定性定量檢測(cè)燕窩中唾液酸含量，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，這兩種方法具有分析時(shí)間短和流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合于快速檢驗(yàn)。雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)檢測(cè)方法（ELISA）利用燕窩中唾液酸以特異性的唾液酸糖蛋白形式存在的特點(diǎn)設(shè)計(jì)出的檢驗(yàn)方法，該方法不僅具有高靈敏度和高特異性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，還不易受基質(zhì)干擾，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可開(kāi)發(fā)成商品化試劑盒，可在商業(yè)上推廣。

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[4]馮婷玉,薛長(zhǎng)湖,孫通，等.燕窩中唾液酸的DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 測(cè)定方法研究[J].食品科學(xué),2010（08）:233-236.

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