齊元富 李慧杰 于連洋 (山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南 250011)

據(jù)專家預(yù)測(cè)，到2025年我國(guó)的肺癌死亡數(shù)將達(dá)到100萬(wàn)/年〔1〕。因此，尋找高效、低毒新型的抗腫瘤藥物已成為治療肺癌的當(dāng)務(wù)之急。雄黃具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，但其毒性較大，而采用納米技術(shù)將其納米化可降低毒性〔2〕。本實(shí)驗(yàn)從調(diào)控腫瘤血管生成的角度探討納米雄黃抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 細(xì)胞系人肺腺癌A549細(xì)胞株，購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞室。

1.2主要試劑藥品 雄黃原藥(購(gòu)自陜西康惠制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)091201);順鉑(DDP，齊魯制藥廠);RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季清生物公司);胰蛋白酶(伯安生命技術(shù)有限公司);兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)一抗、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)一抗、兔抗人β-catenin一抗、濃縮型SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物有限公司);總RNA提取試劑盒(北京Solarbio科技生物公司);VEGF上下游引物及β-actin內(nèi)參:由博尚生物有限公司合成(VEGF基因上游引物序列為GGACAAGTCACCACAGGA，下游為GGAGAAAATCAAGTCGTG，片段長(zhǎng)度為142 bp;內(nèi)參β-actin上游引物序列為GACTACCTCATGAAGGTC，下游為GATCCACATCTGCTGGAA，片段長(zhǎng)度500 bp)。

1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱BB5060UV型(德國(guó)Heraeus公司);倒置相差顯微鏡1X50S8F型(日本Olympus公司);凝膠成像分析系統(tǒng)2200型(美國(guó)Alpha公司);梯度PCR儀T-gradient型(德國(guó)Biometro公司);PCR儀Sprint型(英國(guó)Thermo Hybaid公司)。

1.4納米雄黃制備 由山東龍脈科技發(fā)展有限公司龍脈精研機(jī)(型號(hào)LVM-80WE)研磨納米化，由濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司光子相關(guān)納米激光粒度分析儀(型號(hào)Winner801)測(cè)定納米雄黃顆粒尺寸大小和粒徑分布，平均粒徑約72.79 nm，符合納米藥物制劑要求。KCl飽和硝酸溶液溶解納米雄黃，配成2 mg/ml的混懸液，NaOH調(diào)pH至7.0，磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)藥物干預(yù);納米雄黃組:10%納米雄黃組、20%納米雄黃組;DDP組:DDP終濃度為2 μg/ml;聯(lián)合組(納米雄黃+順鉑):10%聯(lián)合組、20%聯(lián)合組。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)及其懸液制備 將人肺癌A549細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿貼壁，即可傳代，一般3 d傳代一次，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。制備細(xì)胞懸液時(shí)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞株，經(jīng)0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)后細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)制備待用。

1.7RT-PCR法檢測(cè) 提取總RNA:培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，平均分瓶，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛長(zhǎng)滿后，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別制成細(xì)胞懸液，分裝入離心管，400 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，按總RNA抽提試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)ND-1000檢測(cè)RNA的純度與含量用于RT-PCR檢測(cè)。RT-PCR參照試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)攝取圖像，用該系統(tǒng)自帶的分析軟件分析各目的條帶和內(nèi)參的平均密度值-灰度值，用目的條帶的灰度值除以內(nèi)參的灰度值，即所需要的相對(duì)表達(dá)量。

1.8免疫組化測(cè)定 高溫消毒蓋玻片放入六孔板中，制備A549細(xì)胞懸液種板，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬玻片成功后，按實(shí)驗(yàn)分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄液，PBS清洗，95%乙醇固定，0.5%Triton X-100室溫孵育15 min，3%H2O2室溫孵育，封閉血清室溫孵育，一抗工作液濕盒37℃孵育60 min，PBS清洗，二抗工作液濕盒37℃孵育30 min，PBS清洗，SABC濕盒37℃孵育30 min，DAB染色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，自來(lái)水洗滌泛藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR法檢測(cè)納米雄黃對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的影響納米雄黃組、DDP組、聯(lián)合組條帶灰度低于對(duì)照組，10%、20%納米雄黃組條帶亮度依次變低，聯(lián)合組條帶亮度較DDP組及納米雄黃組低，20%聯(lián)合組條帶亮度最低(見(jiàn)圖1)。其中，對(duì)照組的VEGF相對(duì)表達(dá)量明顯高于納米雄黃組、DDP組與聯(lián)合組(P＜0.05);10%納米雄黃組VEGF相對(duì)表達(dá)量明顯高于20%納米雄黃組(P＜0.05);各納米雄黃組與DDP組的VEGF相對(duì)表達(dá)量明顯高于聯(lián)合組(P＜0.05);10%聯(lián)合組VEGF相對(duì)表達(dá)量高于20%聯(lián)合組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 VEGF mRNA表達(dá)凝膠電泳圖

2.2免疫組化法檢測(cè)納米雄黃對(duì)HIF-1表達(dá)的影響 HIF-1陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)、胞核、胞膜為棕黃色顆粒，見(jiàn)圖2，說(shuō)明納米雄黃對(duì)A549細(xì)胞HIF-1有明顯抑制作用，并隨濃度增大抑制作用增強(qiáng)，各納米雄黃組抑制作用均不及DDP組，相比均有顯著性差異(P＜0.05);而二者聯(lián)合組抑制作用同單一納米雄黃及DDP組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，且各藥物組HIF-1表達(dá)均低于對(duì)照組，相比均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組VEGF、HIF-1陽(yáng)性表達(dá)比較(s，%，n=6)

表1 各組VEGF、HIF-1陽(yáng)性表達(dá)比較(s，%，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與10%納米雄黃組比較:2)P＜0.05;與DDP組比較:3)P＜0.05;與10%聯(lián)合組比較:4)P＜0.05

64.50±6.67 45.50±4.67 10%納米雄黃組 53.73±5.461)3) 40.76±3.961)3)20%納米雄黃組 44.74±4.541)2)3) 36.74±3.541)2)3)DDP組 38.97±3.581)2) 32.07±3.781)2)10%聯(lián)合組 27.76±3.011)2)3) 30.76±3.011)2)3)20%聯(lián)合組 20.56±2.691)2)3)4) 25.56±2.691)2)3)4)VEGF HIF-1對(duì)照組組別

圖2 HIF-1免疫組化結(jié)果(×20)

3 討論

血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，血管生成的阻斷是抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的有效手段，近十年，隨著人們對(duì)腫瘤血管生成機(jī)制的深入研究，實(shí)體瘤的抑制可通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的說(shuō)法已得到廣泛認(rèn)可〔3〕。目前比較受關(guān)注的血管生成促進(jìn)因子有VEGF、HIF-1，二者均與誘導(dǎo)腫瘤微血管的形成有著密切的作用。VEGF是參與血管生成的主要正向調(diào)節(jié)因子，是目前發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生血管網(wǎng)的最重要的細(xì)胞因子，它通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂及遷移，重塑細(xì)胞外基質(zhì)及增加血管通透性，從而調(diào)節(jié)病理性血管生成〔4〕。HIF-是存在于哺乳動(dòng)物與人體內(nèi)維持機(jī)體對(duì)缺氧的適應(yīng)能力的一種轉(zhuǎn)錄因子，而腫瘤細(xì)胞常處于缺氧狀態(tài)，HIF-1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和基因調(diào)控作用，通過(guò)誘導(dǎo)VEGF、EGF等腫瘤血管生成相關(guān)因子及其受體的表達(dá)，啟動(dòng)腫瘤新血管生成，改善組織氧供，同時(shí)也表明了HIF-1是腫瘤血管形成的核心調(diào)節(jié)因子〔5，6〕。中藥具有毒性較小、用法比較靈活等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)諸多中藥具有抗腫瘤作用，雄黃是目前研究已表明具明顯的抗腫瘤作用的中藥之一，而采用納米技術(shù)解決雄黃的難溶問(wèn)題，不僅能提高其生物利用度和藥效，還能增強(qiáng)對(duì)瘤細(xì)胞的靶向性及降低毒副作用〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明納米雄黃能顯著降低VEGF與HIF-1在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，以減少腫瘤的血管生成。初步揭示納米雄黃可能是通過(guò)下調(diào)VEGF、HIF-1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞血管生成來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，其具體途徑則有待進(jìn)一步深入研究。

1 湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)〔M〕.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2011:1070.

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3 曾益新.腫瘤學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:516.

4 Ho QT，Kuo CJ.Vascular endothelial growth factor:biology and therapeutic applications〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2007;39(7):1349-57.

5 張素貞，張 凡，常永霞，等.宮頸癌不同部位HIF-1A、VEGF、p53表達(dá)對(duì)腫瘤血管生成作用的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(4):465-7.

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7 楊 玥，陳 靜，易 娟，等.納米雄黃對(duì)肺癌A549細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2010;26(6):36-9.