高 涵 周 濤 陳宏月 張春晶 李淑艷

(齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

細胞周期蛋白(Cyclin)D是細胞周期的啟動因子，作用于G期，在細胞增殖中發(fā)揮著重要作用〔1〕。Cyclin依賴性激酶調節(jié)亞基(CKS)1是高度保守的細胞周期調節(jié)蛋白(SUCl/CDK)蛋白家族成員之一，能與其他周期蛋白依賴性激酶和磷酸化的蛋白結合，參與細胞周期的調控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關〔2〕。血紅素加氧酶(HO)是機體內血紅素分解代謝過程中重要的限速酶，包括氧應激誘導型(HO-1)、組成型(HO-2)及尚未明確的HO-3〔3〕。HO-1與腫瘤增殖、凋亡、血管發(fā)生等生物學行為密切相關〔4〕。但是目前關于HO-1在肝癌細胞中如何調節(jié)細胞周期調控因子尚未見報道。本文對HO-1活性改變對肝癌細胞周期調控因子CKS1和Cyclin D的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1主要材料 人肝癌細胞系HepG2細胞，由北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心提供;脂質體Lipofectamine RNAi MAX、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM，購自美國LIFE TECHNOLOGIES公司;胎牛血清，購自杭州四季青有限公司;噻唑藍(MTT)試劑盒，購自美國Sigma公司;鼠抗人Cyclin D單抗、鼠抗人CKS1單克隆抗體、兔抗人HO-1單克隆抗體、兔抗人三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，購自美國SANTA CRUZ公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑，購自上海生工生物有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒，購自北京鼎國生物有限公司;Trizol試劑，購自美國PROMEGA公司;SYBR Green PCR Reagents，購自美國ABI公司。HO-1 siRNA及熒光標記的siRNA由AMBION公司化學合成(正義:5＇-AACUUUCAGAAGGGCCAGGUGTT-3＇，反義:5＇-CACCUGGCCCUUCUGAAAGUUTT-3＇)。HO-1、cyclin D 和 CKS1 的 PCR 引物由美國LIFE TECHNOLOGIES公司合成。HO-1引物，正義:5＇-TCT CCA AAA TGC CAG AGG CG-3＇，反義:5＇-AGG AAG TTG TTG GGG CTC CT-3＇，產物長度 452 bp;Cyclin D 引物，正義:5＇-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3＇，反義:5＇-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3＇，產物長度 196 bp;CKS1 引物，正義:5＇-TAC CAC GCA GCA GAG TTT GA GT-3＇，反 義:5 ＇-AGC AAG ATG TGA GGT TCT GG TTC-3＇，產物長度170 bp;GAPDH引物，正義:5＇-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AA TG-3＇，反義:5＇-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3＇，產物長度 105 bp。

1.2主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，購自美國SHELAB;EXL808全自動酶標儀，購自美國BIO-TEK公司;ABI 7500 Real Time PCR System，購自美國ABI公司;KodaK4000 MM顯像系統(tǒng)，購自美國CARESTREAM HEALTH公司。

1.3細胞培養(yǎng) HepG2細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、丙酮酸鈉(20 000 U/L)、谷氨酰胺(20 000 U/L)、青霉素(200 000 U/L)和鏈霉素(0.02 g/L)的MEM培養(yǎng)基，隔天換液，胰蛋白酶消化后進行傳代。

1.4細胞轉染 將生長狀態(tài)良好的細胞以6×105/孔接種于6孔板中，將細胞分為轉染組、陰性對照組和空白對照組，每組設6個復孔。各組細胞融合度達到80% 進行轉染實驗，按Lipofectamine 2000試劑盒操作說明書配制質粒和脂質體復合物，轉染體系為 200 μl，每孔體積為 500 μl，轉染后繼續(xù)放入 37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，同時設空白對照組和陰性對照組，空白對照組采用培養(yǎng)基代替轉染體系，陰性組加入陰性對照表達載體。轉染6 h后換為含10%胎牛血清、丙酮酸鈉(20 000 U/L)、谷氨酰胺(20 000 U/L)、青霉素(200 000 U/L)和鏈霉素(0.02 g/L)的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。1.5MTT法測定各組細胞增殖情況 各組細胞轉染20 h或44 h時每孔加20 μl濃度為5 mg/ml的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶解結晶，置搖床上低速振蕩10 min后在酶標儀490 nmol/L處測量各孔的吸光度(A)值。

1.6RT-PCR各組細胞HO-1、CKS1和Cyclin D的表達 各組細胞轉染48 h后按照說明書提取試劑盒制備總RNA。取RNA樣品，用核酸分析儀進行定量，測定260 nm和280 nm的吸光度(A)值，控制 A260/A280在1.9～2.1。RT-PCR按照 SYBR Green PCR Reagents說明書應用ABI 7500 Real Time PCR System進行擴增。擴增反應條件:95℃預變性2 min，94℃ 45 s，64.5℃ 90 s，72℃ 60 s，45 個循環(huán)，最后在72℃延長10 min。使用基于內參物GAPDH的相對定量分析，目的基因mRNA表達量用2-⊿⊿Ct計算轉錄水平的差異。

1.7Western印跡檢測CKS1的表達 各組細胞轉染后48 h，0.25%胰酶消化細胞并收集至EP管并加入蛋白酶抑制劑。各孔加入RIPA細胞裂解液，收集細胞，離心10 min，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，超聲切割30 s后4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量法測各組蛋白濃度。取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳。電泳后半干轉至聚丙烯酰胺凝膠，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入HO-1、CKS1和Cyclin D抗體孵育，4℃過夜。室溫下PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的IgG室溫孵育60 min，洗膜緩沖液洗膜3次，進行化學發(fā)光，顯影、定影。上述反應以β-actin作為內參照，以目標蛋白灰度值與內參灰度值的比值作為其蛋白表達量。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.0軟件進行分析，計量資料以s表示，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)差異。

2 結果

2.1各組細胞增殖情況的比較 MTT實驗結果顯示，HO-1 siRNA轉染組細胞轉染后24 h和48 h的吸光度較空白對照組顯著降低(P＜0.01)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA轉染后HepG2細胞增殖能力顯著降低，轉染后培養(yǎng)24 h或48 h時增殖能力分別較空白對照組降低37.38%和40.54%。見圖1。

2.2各組細胞HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA表達的比較HO-1 siRNA轉染組細胞轉染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA水平較空白對照組顯著降低(P＜0.01)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA轉染后HepG2細胞HO-1、CKS1和Cyclin DmRNA水平顯著降低，轉染后培養(yǎng)48 h時HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA分別較空白對照組降低68.51%、21.18%和41.10%。見圖2。

2.3各組細胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表達的比較 HO-1 siRNA轉染組細胞轉染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平較空白對照組顯著降低(P＜0.01)，而空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA轉染后HepG2細胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平顯著降低，轉染后培養(yǎng)48 h HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白分別較空白對照組降低65.67%、23.08%和40.47%。見圖3。

圖1 各組細胞增殖情況的比較

圖2 各組細胞HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA的表達

圖3 各組細胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表達的比較

3 討論

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位，我國是乙型肝炎大國，肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的55%，發(fā)病率居我國惡性腫瘤第2位〔5〕。由于肝癌早期診斷缺乏有效手段，導致肝癌發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已是中晚期，5年生存率僅為7%〔6〕，探索更加有效的肝癌治療方案仍是目前肝癌研究的主要目標。HCC的發(fā)生是一個多階段、多步驟、逐漸演變的過程。近幾年越來越多的研究表明HO-1參與癌癥的發(fā)生發(fā)展〔7〕。HO-1 在胃腺癌、膠質瘤、乳腺癌等的高表達〔8～10〕。HO-1的過表達與惡性腫瘤的發(fā)展和預后密切相關，但目前還沒有定論?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因作用的歸結點均在于對細胞周期的調控。實驗研究表明，HO-1及其分解產物能影響正常細胞和某些癌細胞的細胞周期〔11〕。但是在肝癌細胞中HO-1如何調節(jié)細胞周期調控因子卻鮮有報道。

CKS1是周期蛋白依賴性激酶復合物的亞基，是高度保守的細胞周期調節(jié)蛋白SUCl/CDK家族成員之一，可以與細胞周期蛋白依賴性激酶相互作用，促進泛素化Cyclin-Cdk抑制蛋白p27kipl的降解，使細胞停滯在G1期，實現(xiàn)其細胞調控功能，從而抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，最終抑制腫瘤的發(fā)生。研究證明，CKS1在多種類型的腫瘤中過表達，是潛在的腫瘤細胞輻射敏感性調節(jié)靶點〔12〕。CKS1在老年HCC組織中的表達與腫瘤細胞的分化程度明顯相關，提示CKS1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的協(xié)同作用〔13〕。Cyclin是參與細胞周期調控的主要因子，Cyclin D是一種重要的G1/S期正性調控分子，其基因的結構或功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。原癌基因Cyclin D成于G1早期，是細胞增殖G1-S期的重要控件。已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中都有Cyclin D高表達，Cyclin D過調節(jié)細胞周期使之始終處于旺盛分裂狀態(tài)，細胞能夠不斷分裂增殖而最終形成腫瘤〔14〕。本研究說明HO-1 siRNA轉染后肝癌HepG2細胞增殖能力顯著降低，因此降低HO-1的活性可顯著抑制HepG2細胞的增殖能力。另外，HO-1 siRNA轉染可顯著抑制肝癌HepG2細胞周期調控因子CKS1和Cyclin D表達，因此推測HO-1對肝癌細胞HepG2增殖作用的影響是通過調控細胞周期因子CKS1和Cyclin D表達而實現(xiàn)。

綜上所述，HO-1的活性降低可抑制肝癌HepG2細胞的增殖，其調控作用可能通過降低HepG2細胞CKS1和Cyclin D表達而實現(xiàn)。

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