朱向東 曹燕飛 汪 斌 王 燕 段永強 (甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是以腹痛腹瀉、黏液膿血便持續(xù)或反復(fù)發(fā)作為主要臨床癥狀，以結(jié)腸黏膜及黏膜下層炎癥和潰瘍形成為病理特點的慢性非特異性腸道疾病。該病發(fā)病原因及機制尚不完全清楚，加之其病情纏綿難愈，復(fù)發(fā)率高，且有癌變傾向，目前尚缺乏滿意的治療方法，已被列為現(xiàn)代難治病之一〔1〕。本研究旨在探討痛瀉要方治療性UC的療效，藥效作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用SPF級Wistar大鼠30只，體重(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗動物中心提供，SPF級動物質(zhì)量合格證號:SCXKC(甘)2004-0006;SPF級實驗設(shè)施合格證號:SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2主要藥物與試劑 痛瀉要方制劑的主要制備方法:痛瀉要方顆粒(由陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)等四味藥物組成)，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室協(xié)助加工制備。按處方比例取陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3次醇提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，醇提取濃縮液干燥得干膏，干膏粉碎成細(xì)粉，加入揮發(fā)油。實驗用不含賦形劑的浸膏，冰箱保存?zhèn)溆谩?，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS):購于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，由美國sigma公司生產(chǎn)，批號為〔2008-16-2〕。髓過氧化物酶(MPO)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、MDA檢測試劑盒，購于南京建成生物工程技術(shù)研究所。

1.3造模方法 采用TNBS/乙醇溶液灌腸結(jié)合束縛法制備UC肝郁脾虛大鼠模型:模型組和痛瀉要方組每天采用束縛器束縛大鼠四肢，并且限制其自由活動，每次6 h。束縛器束縛1 w后，開始行TNBS/乙醇溶液灌腸制備模型。將模型組和痛瀉要方組大鼠禁食24 h，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管慢慢注入距大鼠肛門約7～8 cm深的結(jié)腸處，在腸腔里置留數(shù)分鐘，并且讓大鼠處于平躺狀態(tài)，待其自然清醒。第2天即成功復(fù)制UC模型。UC模型成功后，每日仍繼續(xù)用束縛器束縛大鼠四肢，持續(xù)1 w?？瞻捉M10只大鼠用同樣的方法予50%乙醇溶液灌腸。第3周末處死大鼠。

1.4分組與給藥 將實驗動物分為3組:空白組、模型組、痛瀉要方組，每組10只。除空白組外均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸。痛瀉要方組按生藥22 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的10倍折算)，灌胃體積均為10 ml/kg，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2天開始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。3 w后，處死，取標(biāo)本。

1.5取材和指標(biāo)觀察 給藥21 d后，脫頸椎處死，摘取脾臟與胸腺，稱質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。迅速分離結(jié)腸、剪開、生理鹽水沖洗干凈，將腸黏膜向上平鋪于蠟板上固定，剪取結(jié)腸組織病變嚴(yán)重的部分，一部分用于觀察結(jié)腸組織PPAR-γ蛋白表達(dá)，一部分用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、病理切片，行HE染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)，并參考結(jié)腸病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，由兩位富有經(jīng)驗的病理教研室老師進(jìn)行雙盲評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為:①炎細(xì)胞浸潤:無0分，輕度1分，重度2分;②浸潤深度:黏膜層1分，黏膜和黏膜下層2分，結(jié)腸全層3分;③潰瘍深度:無0分，上皮1分，黏膜固有層2分，黏膜肌層3分。一部分結(jié)腸組織稱重后剪碎、勻漿、離心，取上清液置于冰箱保存，檢測時取結(jié)腸組織上清液分別測定 SOD、MDA、MPO、T-AOC活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6免疫組織化學(xué)檢測 采取經(jīng)典的 SABC法，其主要步驟是:將固定好的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。每張切片滴加3%H2O2，室溫放置10 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。分別滴加PPAR-γ一抗，4℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。滴加試劑SABC，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。DAB顯色劑，蘇木素輕度復(fù)染3 min;經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察結(jié)果，拍片。染色對照:同一組片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步驟同上。

1.7PPAR-γ蛋白表達(dá)結(jié)果判定及測量方法 PPAR-γ蛋白表達(dá):主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸組織中的腸道黏膜及黏膜下層，以胞質(zhì)為主。PPAR-γ表達(dá)陽性為胞質(zhì)呈黃綠顆粒染色，顏色越深，表達(dá)越強，未出現(xiàn)黃綠顆粒，為陰性。采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)之免疫組化分析系統(tǒng)，隨機選取5個視野，測量陽性細(xì)胞平均灰度值，灰度值大，蛋白表達(dá)多，反之則表達(dá)少。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀態(tài) 模型組大鼠于造模后均出現(xiàn)肛門糞便沾染，大便稀軟不成形，精神萎靡不振，毛色逐漸變暗、無光澤、懶動、喜扎堆、豎毛、食量下降、便稀、體重下降等表現(xiàn)，經(jīng)過痛瀉要方治療后，大鼠皮毛逐漸變得光亮整潔，精神狀態(tài)逐漸趨向好轉(zhuǎn)，治療結(jié)束后活動活躍，大便由稀便逐漸至成形，軟硬適中，與正常組相一致。

2.2痛瀉要方對UC大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響 模型組大鼠結(jié)腸組織有潰瘍，且潰瘍面較大，潰瘍深度大多至黏膜肌層;有明顯的炎細(xì)胞浸潤，且浸潤深至全層;可見血管擴張充血、有糜爛，病變結(jié)腸黏膜可見中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體明顯減少及破壞，黏膜下層部分可見血管增生。痛瀉要方治療組損傷明顯改善，潰瘍基本愈合，腺體增生愈合，有明顯的愈合面存在。結(jié)腸病理組織學(xué)評分結(jié)果見表1、圖1。

2.3痛瀉要方對UC大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響空白組PPAR-γ蛋白大量表達(dá)。模型組PPAR-γ蛋白表達(dá)較少，數(shù)量較少;痛瀉要方組PPAR-γ蛋白表達(dá)較強，數(shù)量較多。陽性細(xì)胞平均光密度值結(jié)果見表1、圖1。

表1 痛瀉要方對UC模型大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ蛋白表達(dá)平均光密度值的影響(x ± s，n=10)

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)和PPAR-γ免疫組化結(jié)果

2.4痛瀉要方對UC大鼠胸腺、脾臟指數(shù)及結(jié)腸組織MPO、TAOC、SOD活性及MDA活性的影響 見表2～表4。

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的比較(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠結(jié)腸組織MPO和T-AOC的比較(x ± s，n=10)

表4 各組大鼠結(jié)腸組織SOD和MDA的比較(x ± s，n=10)

3 討論

本實驗觀察到模型組大鼠結(jié)腸組織有潰瘍，且潰瘍面較大，潰瘍深度大多至黏膜肌層;有明顯的炎細(xì)胞浸潤，且浸潤深至全層;可見血管擴張充血、有糜爛，病變結(jié)腸黏膜可見中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體明顯減少及破壞，黏膜下層部分可見血管增生，說明UC模型的制作是成功的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中結(jié)腸黏膜免疫紊亂被認(rèn)為是公認(rèn)的發(fā)病機制〔2〕。氧自由基(OFR)在UC發(fā)病程中起著重要作用，已有大量直接或間接的證據(jù)提示UC腸黏膜中OFR水平明顯升高。SOD活性是反映細(xì)胞膜功能和機體炎癥反應(yīng)的主要指標(biāo)。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，反映機體細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度〔3〕。本實驗結(jié)果提示在UC的發(fā)病中，氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)很可能起著重要作用。經(jīng)痛瀉要方治療后UC大鼠結(jié)腸組織中SOD活性明顯升高，MDA濃度明顯下降，證明痛瀉要方具有清除細(xì)胞中的氧自由基，提高組織中SOD活性、抑制MDA的產(chǎn)生，穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用;T-AOC能反映機體抗氧化系統(tǒng)協(xié)同完整的抗氧化能力〔4，5〕。本實驗結(jié)果提示痛瀉要方具有良好的抗氧化能力，這可能是其對腸黏膜修復(fù)的作用機制之一;脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化是反映機體免疫功能狀態(tài)的敏感指標(biāo)，有研究證實UC大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯降低〔6〕。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠脾臟指數(shù)明顯低于空白組，可能與大鼠結(jié)腸組織局部的炎性反應(yīng)、免疫功能紊亂有關(guān)〔7〕。經(jīng)痛瀉要方治療后，UC大鼠胸腺、脾臟指數(shù)均明顯升高，說明痛瀉要方可能是通過恢復(fù)UC大鼠胸腺和脾臟的功能而實現(xiàn)對免疫反應(yīng)異常的調(diào)節(jié)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ具有調(diào)節(jié)炎癥、脂肪代謝、細(xì)胞分化、免疫等作用〔8〕，參與多種慢性免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展。特別是PPAR-γ在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)中的作用是近年研究的熱點〔9〕，臨床上 PPAR-γ 激動劑治療 UC 確有療效〔10～12〕。本研究提示PPAR-γ的表達(dá)變化可能參與了 UC發(fā)病，痛瀉要方提高PPAR-γ的表達(dá)水平可能是其治療UC的作用機制之一。

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