楊曉帆 安 寧 趙維娜 楊印東 陳 培

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

目前關(guān)于阿爾茨海默病(AD)的具體發(fā)病機制沒有定論，氧化應(yīng)激及其凋亡機制已經(jīng)引起神經(jīng)病學(xué)專家廣泛關(guān)注，β淀粉樣多肽(Aβ)已被證實可作為構(gòu)成AD特征性病變老年斑(SP)的核心成分〔1～6〕。依達拉奉(MCI-186)作為一種新的特異性較強的自由基清除劑，能夠利用強大的對·OH的清除能力，來阻止毒性羰基化合物的生成，發(fā)揮其抗氧化作用〔7〕。本研究探討MCI-186治療對AD大鼠行為學(xué)和核因子(NF)-κB p65及Caspase-3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 Aβ25～35(北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));MCI-186(北京達科為生物技術(shù)有限公司，SIH-152-250MG);小牛血清清蛋白(美國，Sigma公司)，胰蛋白酶、D-Hanks液(美國，伯樂Bio-Rad公司);細胞培養(yǎng)基(DMEM)、乙二胺四乙酸(EDTA)(美國，Gibco公司)。

1.2動物處理 Wistar大鼠，雄性，3～4個月齡，體重200 g左右，自由飲水及攝食。首先給予水迷宮試驗，篩選活動正常者，隨機分為正常對照組(不給予任何處理)、假手術(shù)組(只鉆顱、不給予 Aβ1～40注射)、AD組(給予雙側(cè)海馬多點位注射Aβ1～40)、小劑量組(側(cè)腦室注射 MCI-186，0.2 μg/μl，10 μl)、中劑量組(0.5 μg/μl，10 μl)、大劑量組(0.8 μg/μl，10 μl)。每組30只。

1.3AD大鼠模型的建立 大鼠給予腹腔麻醉并固定，于雙側(cè)海馬(中線旁開2.2 mm、前囟點后1.4 mm)7個不同部位注射預(yù)先在 37℃ 恒溫箱中孵育 7 d的 Aβ1～40，每個位點注射3 nmol/d×7 d。在首次實驗時在背側(cè)丘腦前方顯微注射10 ng轉(zhuǎn)化生長因子β，以促進Aβ沉積。

1.4給藥方法 MCI-186組:癡呆模型制備7 d后開始側(cè)腦室注射，連續(xù)14 d。假手術(shù)組和AD組均于造模成功后給予注射生理鹽水10 μl。注射持續(xù)10 min左右，待完畢仍應(yīng)緩?fù)０吾? min。正常對照組實驗結(jié)束給予注射亞甲藍溶液2 μl。

1.5行為學(xué)測定 采用Morris水迷宮法，進行定位航行實驗和空間探索實驗，分別與造模前、造模后第1～6天測定大鼠找到平臺所需時間(即逃避潛伏期)和2 min內(nèi)跨越原平臺所在位置的次數(shù)，每日2次取平均成績。

1.6Caspase-3、NF-κB P65基因的mRNA表達的測定 按Trizol試劑盒說明提取總 RNA。利用 RT-PLR檢測 Caspase-3、NF-κB P65基因的 mRNA表達，用紫外分光光度儀測定A260 nm/A280 nm，比值1.9～2.0，計算RNA含量。引物設(shè)計參照文獻〔8〕:① NF-κB P65:正義鏈 3＇-GGACACATCGGTAACATAGA-5＇，反義鏈 3＇-CGTCTTTCTTCTGTAACTCC-5＇(擴增產(chǎn)物493 bp);②Caspase-3:正義鏈 3＇-GGTGACAGACAGAGTTATGG-5＇，反義鏈 3＇-CGTTTCTTTTGTCTAGGGTAC-5＇(擴增產(chǎn)物280 bp);③β-actin:正義鏈 3＇-ACATCTTTCACACCACGTTTA-5＇，反義鏈 3＇-GACTCTCCCTTTAGCACGCACT-5＇(擴增產(chǎn)物 380 bp，為內(nèi)參照)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒操作。RT-PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.7Caspase-3和NF-κB P65片段蛋白表達 常規(guī)提取細胞核蛋白，并利用Western印跡檢測Caspase-3活性片段和 NF-κB P65蛋白表達。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS15.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2結(jié)果

2.1各組水迷宮實驗逃避潛伏期 與假手術(shù)組比較，AD組第1～6天逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05或P＜0.01);與AD組比較，小劑量組第4～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，中劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，大劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05或P＜0.01);與小劑量組比較，大劑量組第2～6天逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

2.2各組水迷宮實驗2 min內(nèi)跨越原平臺所在位置的次數(shù)與假手術(shù)組比較，AD組第1～6天跨越原平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05或P＜0.01);與AD組比較，小劑量組第4～6天跨越原平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05)，中劑量組第2～6天跨越原平臺次數(shù)明顯增加(P＜0.05)，大劑量組第2～6天跨越原平臺次數(shù)明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);與小劑量組比較，大劑量組第2～6天跨越原平臺次數(shù)明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表1 各組水迷宮實驗潛伏期(s，x ± s，n=30)

表2 各組水迷宮實驗跨越原平臺次數(shù)(x ±s，n=30，次)

2.3各組Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達的測定 經(jīng)不同劑量的MCI-186處理后，Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達降低明顯，且隨著劑量的增加，Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達降低更明顯，見圖1。

圖1 各組Caspase-3和NF-κB P65 mRNA表達

2.4各組Caspase-3和NF-κB P65蛋白表達的測定 經(jīng)不同劑量的MCI-186處理后，Caspase-3和NF-κB P65蛋白條帶逐漸變細，且隨著劑量的增加，Caspase-3和NF-κB P65蛋白條帶逐漸變細更明顯。見圖2。

圖2 各組Caspase-3和NF-κB P65蛋白表達

3討論

AD發(fā)病機制較復(fù)雜，可能受遺傳、代謝及環(huán)境等眾多因素共同影響 。20世紀70年代，有學(xué)者提出了“膽堿能”假說〔9〕。隨著技術(shù)及相關(guān)研究的不斷深入，后續(xù)又有關(guān)于Aβ沉積、基因突變、炎性損傷、tau蛋白磷酸化過度、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)不平衡等學(xué)說的涌現(xiàn)〔10〕。近些年來，細胞凋亡、氧化應(yīng)激和自由基毒性等對于AD發(fā)病的作用也日益引起學(xué)者的高度關(guān)注〔11，12〕。這些病理過程的發(fā)生、發(fā)展，在AD的致病過程中起著重要作用〔13〕。

Aβ是SP的核心成分，而SP是構(gòu)成AD特征性病變的主要成分，Aβ的出現(xiàn)往往先于神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)的臨床表現(xiàn)及病理改變〔14〕。目前學(xué)術(shù)界一致同意，由Aβ所引發(fā)的神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致AD發(fā)病的最終通路，參與AD的形成及其發(fā)展過程〔15〕。AD轉(zhuǎn)基因鼠及AD患者體外實驗均證實，Aβ沉積并引發(fā)淀粉樣斑塊后，往往會伴有活性氧(ROS)的出現(xiàn)，多光子成像技術(shù)也顯示，NF-κB受到活化，最終使得細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及相關(guān)DNA受到損害，此時內(nèi)源性抗氧化劑發(fā)揮神經(jīng)保護作用已不能對抗ROS引起的神經(jīng)退變。因此，通過自由基損傷引起Aβ 的神經(jīng)毒性作用已經(jīng)成為共識〔16，17〕。

MCI-186是由日本研制并于2001年上市針對自由基能夠進行有效清除的一種制劑，MCI-186利用對·OH的高效清除，可減少過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生，避免腦細胞過氧化所造成的過度損傷〔18〕。動物實驗表明，MCI-186通過降低腦水腫的發(fā)生率，能夠達到恢復(fù)神經(jīng)元缺失、降低或延緩遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡的作用目的，進而能夠有效阻止缺血性腦血管病的發(fā)生及進展。同時，其能夠在缺血再灌注的早期明顯改善缺血誘導(dǎo)的海馬齒狀回突觸長時程增強，提示MCI-186參與學(xué)習(xí)過程，并能能改善缺血患者的記憶能力。本文結(jié)果提示，MCI-186可提高AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，其機制可能與提高大鼠腦組織抗氧化酶活性，減少自由基損傷及降壓作用有關(guān)。

Caspass-3作為Caspase家族成員較為重要蛋白酶的一員，其相關(guān)研究是Caspase家族成員中研究最深入的〔19〕。正常的機體狀態(tài)況下，Caspase是以非活化的酶原狀態(tài)存在，一旦被激活，便能迅速引發(fā)凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，最終出現(xiàn)細胞不可逆死亡。NF-κB作為具有多向轉(zhuǎn)錄及調(diào)節(jié)功效的蛋白質(zhì)，能夠參與機體炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答等重要的生理及病理時期〔22〕。AD患者尸檢結(jié)果顯示神經(jīng)變性過程中NF-κB活性增加。本研究提示MCI-186通過減輕大鼠DNA氧化損傷，加快DNA修復(fù)，改善動物腦血流情況，其機制可能與MCI-186可清除羥基自由基，并減少毒性羰基化合物水平有關(guān)。

綜上，MCI-186能夠提高AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，降低NF-κBp65及Caspase-3 mRNA及蛋白的表達，促進細胞增殖，并能抑制細胞凋亡，從而達到保護神經(jīng)細胞的目的，以0.8 μg/μl MCI-186效果更強。

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