劉品力 陳燕玲 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者最常見并發(fā)癥之一，且為導(dǎo)致終末期腎臟病的第二原因〔1〕。對(duì)于DN發(fā)病機(jī)制，目前尚未有明確的結(jié)論。腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)參與機(jī)體血壓調(diào)控及組織液平衡，而DN患者體內(nèi)常存在RAS系統(tǒng)激活異?！?〕。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)為RAS系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，而編碼ACE基因中第16內(nèi)含子可因出現(xiàn)片段的插入或缺失構(gòu)成基因多態(tài)性〔3〕。研究〔4〕表明，ACE基因多態(tài)性與DN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)在不同種族及環(huán)境中表現(xiàn)出不同傾向。本文選擇ACE與AGT基因研究其與DN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，后者為編碼血管緊張素原基因，且其第2外顯子常出現(xiàn)變異導(dǎo)致編碼產(chǎn)物氨基酸出現(xiàn)替換〔5〕。本研究旨在研究ACE及AGT基因多態(tài)性與DN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間是否存在關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1入組標(biāo)準(zhǔn) DM組:均符合1997年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，患者間無(wú)血緣關(guān)系，且無(wú)高血壓病史或心血管疾病家族史。DN(+)組:符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，尿蛋白陽(yáng)性，3次尿微量白蛋白排泄率(uAE)有2次或以上＞20 μg/min，眼底檢查存在DM性視網(wǎng)膜增殖，以上條件需同時(shí)符合。DN(-)組:符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，尿蛋白陰性，3次檢查均為uAE＜20 μg/min，以上條件需同時(shí)符合。對(duì)照組:無(wú)DM、高血壓、冠心病、腎病及無(wú)糖尿病家族史，以上條件需同時(shí)符合。

1.2一般資料 選擇2008年3月至2012年3月我院收治的2型糖尿病(T2DM)患者。納入患者均符合DM組入組標(biāo)準(zhǔn)，符合DN(+)組入組標(biāo)準(zhǔn)的100例患者納入DN(+)組。同時(shí)從符合DN(－)組入組標(biāo)準(zhǔn)患者中按同性別、同年齡1∶1配對(duì)選取100例編入DN(－)組。DN(+)組與DN(－)組共同構(gòu)成DM組。同時(shí)從我院同一時(shí)間段體檢中心符合對(duì)照組入組條件的健康者中隨機(jī)抽取200例編入對(duì)照組。

1.3檢測(cè)方法 (1)樣本提取:檢測(cè)DNA樣本來(lái)源于提取檢測(cè)對(duì)象外周靜脈血3 ml，常規(guī)肝素抗凝后，采用酚/氯仿法從外周血白細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA。(2)ACE基因I/D多態(tài)性檢測(cè)及分析:對(duì)提取樣本DNA擴(kuò)增ACE基因16內(nèi)含子。引物為 P1:5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’;P2:5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’。反應(yīng)總體系為25 μl。PCR反應(yīng)條件:94°C下預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)為按94°C變性1 min，58°C退火1 min，72°C延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)后，在72°C下延伸5 min，4℃下保存。取擴(kuò)增后產(chǎn)物10 μl于2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，溴乙啶染色，并以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)照。(3)AGT基因M235T多態(tài)性檢測(cè)及分析:對(duì)提取樣本DNA選擇擴(kuò)增AGT基因第2外顯子。引物為P1:5’-CCA GGG TGC TGT CCA CAC TGG CTC CGG-3’;P2:5’-AAG TGG ACG TAG GTG TTG AAA GGG AGG GGT GCT GTC CCA CAC TGG CTT CAA-3’;P3:5’-TGT GGT CCT CCC ACG CTC TCT GG-3’。反應(yīng)體系 25 μl，PCR反應(yīng)條件:94°C下預(yù)變性6 min后，循環(huán)為按94°C變性1 min，62°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，共36個(gè)循環(huán)后，在72°C下延伸5 min。取擴(kuò)增后產(chǎn)物6 μl于12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分析，并以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)、c2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn) DN(+)、DN(-)及對(duì)照組ACE及AGT分布的觀察值與預(yù)期值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，符合遺傳平衡定律。見表1，表2。

表1 ACE基因遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果(Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn))

表2 AGT基因遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果(Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn))

2.2 ACE基因多態(tài)性分析 ACE基因型分為三種:Ⅱ型(ACE基因插入純合型):僅顯示490 bp單條區(qū)帶;DD型(ACE基因缺失純合型):僅顯示196 bp單條區(qū)帶;ID型(ACE基因插入/缺失雜合型):同時(shí)顯示196 bp與490 bp兩條區(qū)帶。DN(+)與DN(－)組基因型分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而DM組與對(duì)照組基因型分布頻率差異顯著(P＜0.01);ACE等位基因?qū)Ρ龋珼N(+)與DN(－)等位基因D/I頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而DM組D頻率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。見表3。

表3 ACE基因多態(tài)性分析結(jié)果〔n(%)〕

2.3 AGT基因多態(tài)性分析 AGT基因型分為:TT型(AGT純合型):僅顯示134 bp單條區(qū)帶;MM型(AGT純合型):僅顯示156 bp單條區(qū)帶;MT型(AGT雜合型):同時(shí)顯示134 bp與156 bp兩條區(qū)帶。AGT基因型分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，DN(+)與DN(－)在AGT基因型分布頻率上差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，兩組在AGT等位基因頻率上無(wú)顯著差異(P＞0.05);DM組與對(duì)照組在基因型分布頻率上差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，兩組等位基因頻率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見表4。

表4 AGT基因多態(tài)性分析結(jié)果〔n(%)〕

2.4ACE與AGT基因聯(lián)合多態(tài)性分析 DM相對(duì)于對(duì)照組ACE基因OR值為2.000(95%CI 1.061～3.770);而在DN(+)與DN(-)中，兩者分別與對(duì)照組相比，OR值較為接近，分別為2.355(95%CI 1.135～4.889)與2.029(95%CI 0.959～4.296)，缺少DD與DN(+)之間存在明顯聯(lián)系證據(jù)。AGT中，DN(+)、DN(-)及 DM組與對(duì)照組相比，OR值接近1，OR=1.521，1.092，1.282;95%CI 0.897 ～ 2.577，0.659 ～ 1.808，0.845～1.945，AGT多態(tài)性與DM或DN間聯(lián)系較弱;ACE與AGT基因聯(lián)合多態(tài)性分析結(jié)果顯示，DD+TT基因型對(duì)于DN(+)OR值為4.042(95%CI 1.717～9.515)，DD+TT對(duì)于DN(-)OR值為3.171(95%CI 1.306～7.698)，對(duì)于DM組 OR值為3.599(95%CI為1.657～7.818)，即同時(shí)具有ACE-DD型與AGT M235T-TT型基因，發(fā)生T2DM及DN危險(xiǎn)度均升高。

3討論

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展及對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的深入研究，目前較為一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，DN為多因素參與，多基因遺傳因素及環(huán)境因素共同作用的疾病。在遺傳因素上，許多研究表明DN存在種群分布及家族分布差異〔7〕。而DN早期，腎臟血流動(dòng)力學(xué)已表現(xiàn)出異常。由于ACE為RAS中的關(guān)鍵酶。無(wú)活性的血管緊張素Ⅰ在ACE作用下C-末端水解去除2個(gè)氨基酸殘基，產(chǎn)生有活性的血管緊張素Ⅱ，同時(shí)滅活緩激肽。血管緊張素Ⅱ可通過(guò)激動(dòng)血管緊張素受體1(AT1)，引起血壓上升、靜脈收縮、刺激醛固酮合成及釋放，促進(jìn)對(duì)Na+重吸收等。因此ACE基因多態(tài)性與DN遺傳因素之間是否存在關(guān)聯(lián)常作為研究DN遺傳因素的起點(diǎn)〔8〕。由于ACE基因位于染色體17q23上，而第16內(nèi)含子在不同人群中存在一個(gè)287 bp的插入或缺失，從而表現(xiàn)出I/D多態(tài)性。因此考慮ACE基因I/D多態(tài)性與DN發(fā)病之間是否存在關(guān)聯(lián)。然而已有研究結(jié)果表明，對(duì)于不同人群研究中，結(jié)論并未統(tǒng)一〔9〕。研究認(rèn)為，在歐洲白種人中，ACE基因I/D多態(tài)性與血漿ACE水平存在關(guān)聯(lián)，為DN發(fā)病的危險(xiǎn)因素〔10〕。而對(duì)于亞洲人種研究中，ACE基因I/D多態(tài)性與DN發(fā)病之間存在多種結(jié)論〔11〕。

本研究結(jié)果提示，ACE基因多態(tài)性可能與T2DM發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)，但無(wú)直接證據(jù)表明ACE基因多態(tài)性與2型DN發(fā)病之間存在直接關(guān)聯(lián)。

綜上所述，由于考慮到DN可能受多基因遺傳因素控制〔12〕，而AGT可生成無(wú)活性血管緊張素Ⅰ，且人AGT基因第2外顯子變異導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物中氨基酸出現(xiàn)替換〔13〕。本研究提示同時(shí)具有ACE-DD型與AGT M235T-TT型基因，發(fā)生T2DM及2型DN危險(xiǎn)度均升高。

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