陳 碩 王二敏 周紅麗 (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

長期腹膜透析可引起腹膜纖維化并最終導致透析失敗。研究發(fā)現(xiàn)，腹膜透析液的生理不相容性因素特別是高糖，一方面直接損傷腹膜間皮細胞(PMC)并抑制其增殖，另一方面通過影響PMC產(chǎn)生多種細胞因子干擾細胞外基質(zhì)的代謝，導致其產(chǎn)生增多，降解減少，最終導致了腹膜纖維化的形成〔1，2〕。目前關(guān)于腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的治療是研究的熱點之一。高遷移率簇蛋白-1(HMGB-1)是新發(fā)現(xiàn)的具有顯著促炎效應(yīng)的細胞因子。糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)即晚期糖基化終末產(chǎn)物受體是HMGB-1明確的高親和力受體，已有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1與RAGE結(jié)合激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，通過EMT及分泌腫瘤壞死因子(TGF-β)最終致肺纖維化〔3〕。但目前國內(nèi)外尚無HMGB-1/RAGE通路在PMC上的研究，我們通過建立體外大鼠培養(yǎng)模型，研究高糖對PMC HMGB-1、RAGE和TGF-β1的影響及三者之間可能存在的關(guān)系，進一步探討高糖介導腹膜損傷和腹膜纖維化發(fā)生的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，質(zhì)量(160±20)g，遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2藥品和試劑 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司);標準胎牛血清(天津灝洋生物有限公司);胰蛋白酶(美國Invitrogen公司);D-葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司);Trizol試劑(大連寶生物);兩步法RT-PCR試劑盒(杭州博日);PCR引物由上海生物工程有限公司合成;大鼠HMGB-1 ELISA試劑盒(美國ADL公司);大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(武漢博士德公司);兔抗大鼠RAGE抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3PMC的原代培養(yǎng)、傳代與鑒定 參考文獻〔4〕進行。

1.4實驗分組 第3代PMC達80%融合時進入實驗。用含2%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細胞同步化。隨機分組:①正常對照組:只加2%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基;②葡萄糖組:不同濃度葡萄糖(1.5%、2.5%、4.25%)培養(yǎng)36 h;2.5%葡萄糖分別作用于PMC 24、36、48 h組。24孔板設(shè)四復孔。

1.5RT-PCR法檢測RAGE mRNA的表達 采用Trizol一步法進行總RNA的抽提，采用RT-PCR試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄PCR，25 μl PCR反應(yīng)體系，RAGE、GAPDH的特異性引物行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并用計算機處理圖像進行光密度掃描，以GAPDH產(chǎn)物吸光度(A)為參照。PCR引物:GAPDH上游:5 ＇-GGCAAGTTCAATGGCACAGT-3 ＇;下 游:5 ＇-AAGGTGGAGGAATGGGAGTT-3 ＇(725 bp);RAGE 上 游:5 ＇-ATGAGCAGAGCGGCTATTCC-3＇;下游:5＇-CACGCTTCGGTCAGAGCTCA-3＇(513 bp)。PCR反應(yīng)條件:GAPDH為95℃預變性5 min;循環(huán)條件為95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。RAGE mRNA為95℃預變性5 min;循環(huán)條件為94℃變性40 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。

1.6Western印跡法檢測RAGE蛋白表達 用細胞裂解法提取總蛋白，總蛋白上樣于12%SDS-PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉60 min后，加入兔抗大鼠 RAGE抗體(1∶200)，小鼠抗大鼠 GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃ 孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，二抗稀釋液(1∶1 500)，室溫孵育2 h，洗膜3次，ECL顯影，掃描儀成像，自動成像系統(tǒng)分析。

1.7ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中HMGB-1和TGF-β1蛋白表達 24孔板細胞經(jīng)干預后，收集上清，離心后棄沉淀，采用ELISA試劑盒根據(jù)其說明進行蛋白質(zhì)含量測定，最后在酶標儀450 nm處即刻測OD值并計算其濃度。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1葡萄糖刺激下PMC RAGE mRNA表達的變化 在葡萄糖刺激下PMC的RAGE mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)，呈劑量依賴性。與正常對照組比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見圖1，表1。2.5%葡萄糖刺激PMC后0～48 h內(nèi)隨著作用時間的延長，RAGE mRNA和蛋白表達增加，呈時間依賴性，與0 h組比較，組間差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見圖 2，表 2。

2.2高糖刺激下PMC HMGB-1表達的變化 結(jié)果顯示2.5%葡萄糖刺激 PMC 0、24、36、48 h，HMGB-1 蛋白表達依次為3.66 ±0.598 9、24.48 ±2.480 4、34.10 ±2.180 4、42.34 ±2.588 6(μg/L)，其蛋白含量顯著增加，呈時間依賴性，與0 h組比較，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。

2.3高糖刺激下PMC TGF－β1表達的變化 結(jié)果顯示2.5%葡萄糖刺激 PMC 0、24、36、48 h，TGF － β1蛋白表達依次為97.12 ±5.072 7、492.10 ±16.435 5、528.72 ± 15.649 4、671.03±21.794 3(ng/L)，其蛋白表達顯著上調(diào)，呈時間依賴性，與0 h組比較，組間差異均具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。

圖1 不同濃度葡萄糖刺激PMC后RAGE mRNA、蛋白的表達

表1 不同濃度葡萄糖刺激PMC后RAGE mRNA和蛋白質(zhì)表達(x ± s，n=5)

圖2 2.5%葡萄糖LPS刺激PMC不同時間后RAGE mRNA及蛋白的表達

表2 2.5%葡萄糖刺激PMC不同時間后RAGE mRNA和蛋白質(zhì)表達(x ± s，n=5)

3討論

維持腹膜透析功能、延長透析時間是近年來對腹膜透析療法研究的熱點，其中關(guān)鍵問題是對腹膜纖維化的預防和治療。腹膜透析液中的高濃度葡萄糖是引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化的重要原因之一。有研究表明，高糖可以促進PMC表達白細胞介素(IL)-1、IL-6、TGF-β 等炎性介質(zhì)〔5，6〕，造成局部炎癥狀態(tài)。而這些促炎細胞因子可通過引起腹腔白細胞聚集以及促進PMC和腹膜成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)(如透明質(zhì)酸)等途徑來影響腹膜的結(jié)構(gòu)與功能，導致腹膜纖維化。因此體外培養(yǎng)PMC使之暴露于實驗因素下，觀察其表達、分泌細胞因子情況是進行抗腹膜纖維化研究的一個重要手段。

HMGB-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種重要的促炎介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)性疾病的病理過程中具有重要作用。隨著對HMGB-1研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅在細胞核內(nèi)基因的組裝、轉(zhuǎn)錄、修復中起重要作用，而且它被釋放到胞外時可作為一種有效的炎癥介質(zhì)誘發(fā)和進一步擴大炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究顯示RAGE與HMGB-1具有高親和力，是HMGB-1的主要受體〔7〕。RAGE為一種跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。RAGE廣泛分布于多種細胞表面，在類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腎病、動脈硬化等多種疾病都與RAGE受體表達上調(diào)有密切關(guān)系〔8〕?，F(xiàn)有證據(jù)表明HMGB-1的促炎效應(yīng)大部分是通過RAGE起作用的，HMGB-1與RAGE的相互作用能活化兩條信號通路，一條涉及Rac和Caco-2途徑，導致細胞骨架重建;另一條涉及Ras-MAPK途徑和隨后NF-κB移位介導的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在正常PMC僅有少量RAGE表達，在高糖作用下RAGE表達上調(diào)，并呈時間及劑量依賴性，表明高糖可激活PMC的RAGE信號轉(zhuǎn)導通路，而高糖又可誘導RAGE的配體HMGB-1表達，高糖與HMGB-1協(xié)同作用進一步擴大炎癥反應(yīng)，并上調(diào)TGF-β1的表達，促進腹膜纖維化的發(fā)生。這些研究結(jié)果為針對HMGB-1靶點的抗腹膜纖維化治療提供依據(jù)和思路。由于PMC激活過程復雜，受多種因素的影響，細胞因子信號在轉(zhuǎn)導過程中，形成錯綜復雜的信號傳輸網(wǎng)絡(luò)，HMGB-1通過RAGE激活PMC的信號通路，及相關(guān)因素之間的相互影響還待進一步研究。

總之，本實驗初步闡明了葡萄糖可激活 PMC HMGB-1/RAGE信號通路，并可上調(diào)TGF-β1的表達，導致腹膜損傷。因此，早期切斷細胞因子間的"交叉對話"，減少這些細胞因子生成或阻斷其與受體結(jié)合及受體后信號傳導通路，對臨床防治腹膜纖維化具有重要意義。

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