韋艷紅 劉 艷 康曉新 趙 宇 尹 璐 (齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬三院老年科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

心肌梗死缺血再灌注(I/R)后心肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量的反應(yīng)性活性氧(ROS)，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)不可逆性開放，使氧自由基釋放并通過級聯(lián)放大作用啟動細(xì)胞凋亡程序，造成心肌I/R損傷。依達(dá)拉奉(MCI-186)是主要用于腦梗死后的神經(jīng)保護劑，其作用機制是通過清除線粒體的ROS而阻止mPTP的開放。近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)MCI-186同樣具有清除心肌線粒體ROS的能力〔1〕，并且在改善大鼠心肌I/R損傷方面具有顯著療效〔2〕。然而，目前研究對象均為青壯年大鼠，對于已出現(xiàn)線粒體呼吸功能減退老年大鼠的研究尚存在空白。本研究通過觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，檢測抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡網(wǎng)蛋白Bax的表達(dá)水平以及mPTP開放程度等，評價MCI-186對老年大鼠I/R損傷后線粒體功能的作用。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 36只雄性18個月齡Wistar大鼠，清潔級，體重(500±20)g，由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，許可證號:SYXK(黑)2006-032。隨機分為假手術(shù)組，I/R組及治療組，每組12只。MCI-186注射液(10 mg∶5 ml)購自南京先聲藥業(yè);兔抗鼠Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素(cyt)C一抗及羊抗兔IgG-AP二抗購自北京中杉金橋公司;線粒體分離試劑盒及TUNEL試劑盒購自碧云天生物科技公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗分組及I/R模型建立 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)麻醉后，仰臥位固定于操作臺，頸胸部備皮消毒后，切開頸部氣管進行機械通氣后在胸骨左緣2～4肋間開胸，分離暴露左心耳及肺動脈圓錐，于左心耳下方應(yīng)用5-0手術(shù)縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支。缺血30 min后，剪斷縫線再灌注180 min，建立I/R模型。其中，假手術(shù)組開胸分離左心耳后不進行結(jié)扎;治療組在再灌注開始時尾靜脈滴注 MCI-186(10 mg/kg溶于30 ml生理鹽水)，30 min內(nèi)滴完。3組均在180 min再灌注結(jié)束后，斷髓處死大鼠，提取心肌組織檢測。

1.3透射電鏡觀察心肌線粒體的形態(tài)變化 取大鼠左心室心肌組織置于2%戊二醛磷酸固定液中固定24 h后常規(guī)脫水、包埋，制成超薄切片，在JEM-100透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)變化。

1.4Western印跡檢測Bcl-2、Bax及cyt C蛋白表達(dá) 取左室前壁心肌組織，加入蛋白裂解液后，12 000 r/min離心30 min，取上清測定總蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，37℃封閉1 h，加入兔抗鼠 Bcl-2(1∶400)、Bax(1∶400)、cyt C(1∶200)一抗，4℃過夜。第2天洗膜后加入羊抗兔IgG-AP(1∶1 000)二抗室溫孵育30 min，洗膜后顯色。采用Image-Pro Plus 4.0軟件分析條帶積分值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算蛋白相對表達(dá)量。蛋白相對表達(dá)量=靶蛋白積分值/GAPDH積分值。

1.5TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 根據(jù)試劑盒操作說明，取大鼠心尖部心肌組織，石蠟包埋后切片染色。在光鏡下觀察，凋亡心肌細(xì)胞核被染成棕褐色，為陽性細(xì)胞。每張切片隨機取5個不相鄰的高倍視野，計數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6分光光度法檢測mPTP的開放水平 根據(jù)線粒體分離試劑盒的說明，取大鼠左室前壁心肌組織，剪碎后加入蛋白裂解液，于冰上研磨為組織勻漿，采用差速離心法分離線粒體。蛋白定量后加入線粒體反應(yīng)緩沖液，使每組線粒體蛋白含量為500 μg。反應(yīng)初始時，分光光度計記錄樣本540 nm處吸光值(A540)后加入 mPTP開放誘導(dǎo)劑 CaCl2(200 μmol/L)，觀察20 min，每隔2 min記錄A540 nm值，計算各時間點A540 nm與初始A540 nm的比值，從而比較mPTP的開放水平。從提取心肌組織至測定結(jié)束，均在1 h內(nèi)完成。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2結(jié)果

2.1心肌線粒體的形態(tài)變化 假手術(shù)組線粒體體積大小正常，偶見不規(guī)則形態(tài)，線粒體間可見脂褐素沉積，為正常衰老心肌線粒體表現(xiàn)。I/R組線粒體不規(guī)則形態(tài)較多，體積明顯增大，嵴排列紊亂，可能是由于mPTP開放導(dǎo)致離子內(nèi)流，進而內(nèi)膜腫脹所致。治療組線粒體形態(tài)基本規(guī)則，腫脹程度較I/R組明顯減輕，嵴排列整齊，總體形態(tài)接近假手術(shù)。見圖1。

2.2Bcl-2、Bax及cyt C的表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，I/R組蛋白表達(dá)均有明顯差異(P＜0.01)，說明再灌注后細(xì)胞出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。而經(jīng)MCI-186治療后，3種蛋白較I/R組有明顯改善(P＜0.05)，說明MCI-186具有一定的抗凋亡作用。見表1。

2.3心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 與假手術(shù)組(3.85±0.59)比較，I/R組AI(16.25±0.98)明顯增高(P＜0.01);與I/R組比較，治療組AI(8.46±1.01)明顯降低(P＜0.01);治療組與假手術(shù)AI有明顯差異(P＜0.01)。說明MCI-186只能在一定程度上減輕心肌細(xì)胞I/R后的凋亡，并不能達(dá)到完全抑制凋亡的水平。見圖2。

2.4mPTP的開放程度 線粒體在540 nm處的吸光值與mPTP的開放程度呈反比。隨著開放誘導(dǎo)劑作用時間的延長，I/R組mPTP開放程度較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，而治療組開放程度低于I/R組(P＜0.05)，說明MCI-186可降低mPTP的開放程度，進而防止線粒體腫脹，從而減輕細(xì)胞凋亡。見表2。

圖1 各組缺血再灌注后心肌線粒體形態(tài)變化(10 000×)

表1 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(x ± s，n=12)

表2 各組不同時間點mPTP開放程度(s，%，n=12)

表2 各組不同時間點mPTP開放程度(s，%，n=12)

與假手術(shù)組相比:1)P＜0.05;與I/R組相比:2)P＜0.05

in 20 min假手術(shù)組 98.63 ±3.03 97.94 ±3.97 96.87 ±3.25 96.23 ±3.87 95.67 ±4.06 95.16 ±4.33 94.69 ±4.06 94.03 ±3.分組 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min 14 min 16 min 18 m 93 93.73 ±4.01 93.25 ±3.26 I/R 組 94.62 ±4.14 90.43 ±3.671)88.26 ±3.451)85.87 ±4.561)83.02 ±4.381)80.04 ±4.261)76.51 ±3.941)74.46 ±4.151)71.25 ±3.861)69.93 ±4.171)治療組 97.34 ±4.58 95.61 ±4.632)94.01 ±4.522)93.41 ±3.972)92.32 ±3.842)91.03 ±4.352)90.45 ±4.212)89.05 ±4.562)87.67 ±3.892)85.15 ±4.112)

圖2 各組心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果(×40)

3討論

線粒體是提供心肌細(xì)胞能量的主要場所，同時也是ROS產(chǎn)生的主要場所。心肌梗死后，心肌細(xì)胞由于缺血缺氧出現(xiàn)變性壞死，同時當(dāng)閉塞血管再開通后，I/R過程使得線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，通過mPTP釋放入胞質(zhì)，進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡裂解所釋放的自由基又引起鄰近細(xì)胞的連鎖式凋亡反應(yīng)，即級聯(lián)放大反應(yīng)，因而在I/R后會出現(xiàn)較梗死時更大面積的心肌壞死。因此，抑制I/R后ROS的產(chǎn)生是治療I/R的主要方法之一。MCI-186是一種新型自由基清除劑，首先被應(yīng)用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病并取得良好的臨床效果〔3〕，近年來動物實驗證明應(yīng)用MCI-186預(yù)處理心肌缺血大鼠可以減少心肌缺血面積〔4，5〕。本文提示心肌纖維的I/R損傷可能不僅是線粒體自由基釋放的損傷，還可能存在其他損傷機制。Bcl-2和Bax是細(xì)胞內(nèi)一對抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，均屬于Bcl-2蛋白家族〔6〕，Bcl-2原癌基因激活后，其產(chǎn)生的Bcl-2蛋白可以抑制細(xì)胞凋亡途徑的啟動，而Bax的高表達(dá)則會啟動凋亡程序。MCI-186具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。cyt C是線粒體氧化呼吸鏈中將電子由復(fù)合體Ⅲ傳遞至復(fù)合體Ⅳ的蛋白，其主要存在于線粒體內(nèi)膜表面。當(dāng)線粒體膜完整性破壞或mPTP開放時，其可流入胞質(zhì)，作為凋亡相關(guān)蛋白啟動凋亡程序〔7〕。本研究說明I/R能夠?qū)е戮€粒體內(nèi)膜完整性破壞，而MCI-186能夠維持線粒體膜穩(wěn)定性。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡，需要線粒體產(chǎn)生的ATP提供能量，如果mPTP大量開放破壞線粒體內(nèi)膜完整性，則會出現(xiàn)ATP合成障礙，導(dǎo)致細(xì)胞直接發(fā)生水腫壞死〔8〕，使TUNEL染色出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，本研究將缺血時間設(shè)定為30 min，避免心肌細(xì)胞發(fā)生大量壞死，并對mPTP開放程度進行檢測，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本文說明I/R線粒體內(nèi)膜穩(wěn)定性較差，其機制可能是由于基質(zhì)Ca2+超載、ROS損傷、cyt C破壞等等，目前尚存在爭論，但就國內(nèi)外研究分析〔9，10〕，是多種因素綜合所造成的結(jié)果。I/R后，心肌通過以ROS為主的多種途徑發(fā)生損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)心臟泵血功能障礙，而MCI-186通過有效清除ROS而保護線粒體穩(wěn)定性，改善呼吸作用，進而減輕I/R后的心肌損傷。本研究未能檢測線粒體呼吸鏈中各復(fù)合體的功能變化，尚需深入研究。

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