林 歡 冷吉燕 于 靜 孟 霖 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院干部病房，吉林 長春 130021)

藍(lán)莓花色苷是從藍(lán)莓果實(shí)中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基〔1〕、降血脂及對(duì)心血管系統(tǒng)保護(hù)作用〔2，3〕。隨著細(xì)胞培養(yǎng)和免疫組化技術(shù)的發(fā)展，黃酮類植物化合物在多種代謝性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、高血壓、糖尿病等的作用機(jī)制研究也越來越深入。本實(shí)驗(yàn)擬利用觀察藍(lán)莓花色苷對(duì)血管緊張素(AngⅡ)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 HUVEC(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)、藍(lán)莓花色苷(本課題組先期提取，并已經(jīng)鑒定)、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司);AngⅡ、二甲基亞砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，美國Sigma公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)器材 低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板(美國Corning公司)。

1.3HUVEC的培養(yǎng)、傳代與鑒定 從液氮罐中取出裝有HUVEC的凍存管，放入37℃水浴箱中不斷搖晃，1 min內(nèi)迅速解凍細(xì)胞懸液，隨即于超凈臺(tái)內(nèi)移入無菌離心管，加入2 ml DMEM高糖培養(yǎng)液，吹打均勻后，1 000～1 200 r/min離3～5 min，棄上清后，再加入DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml，吹打成細(xì)胞懸液，種入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液的25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，次日可見細(xì)胞貼壁生長，換液。3～5 d長滿瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳代后隔天換液，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。用Ⅷ因子相關(guān)抗原(SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法)檢測(cè)陽性鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞。

1.4實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及預(yù)處理 培養(yǎng)瓶中HUVEC生長至60%左右融合，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，細(xì)胞分組處理:(1)空白對(duì)照組(Control):HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)AngⅡ組:HUVEC分別用10－9、10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol/L AngⅡ +10%FBS+DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(3)藍(lán)莓花色苷組:HUVEC分別用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml藍(lán)莓花色苷 +10%FBS+DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)AngⅡ+藍(lán)莓花色苷組:HUVEC在含有20 μg/ml藍(lán)莓花色苷的培養(yǎng)液中孵育2 h后，再加入10～6 mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各組細(xì)胞均置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5培養(yǎng)細(xì)胞的活性鑒定 無菌條件下將細(xì)胞懸液按200 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。根據(jù)上述不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組加藥，設(shè)不加細(xì)胞不加藥組為調(diào)零孔。培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 (1)將傳代后HUVEC接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h;(2)換用DMEM高糖培養(yǎng)液(無血清)作用24 h，使細(xì)胞同步化;(3)按1.2.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及預(yù)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h;(4)0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次;(5)加入400 μl的1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml;(6)在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin VFITC輕輕混勻，2℃ ～8℃避光孵育15 min;(7)加入10 μl的PI后輕輕混勻，2℃ ～8℃避光孵育5 min;(8)1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western蛋白免疫印跡法檢測(cè)Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達(dá) (1)取空白對(duì)照組、AngⅡ組和AngⅡ+藍(lán)莓花色苷組細(xì)胞各一瓶，按各組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥24 h后，用PBS(最好是冷的)洗3遍，吸干，加300 μl RIPA裂解液于冰上或冰盒上反應(yīng)5 min，用細(xì)胞刮刮培養(yǎng)瓶，用移液器分別收集到潔凈的EP管里，于管壁做好標(biāo)記，置于已預(yù)冷至4℃離心機(jī)中反應(yīng)30 min，3 000 r/min離心15 min，分別轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中，做好標(biāo)記后13 000 r/min，離心10 min;(2)加入4×loading buffer，調(diào)蛋白濃度至 0.8 μg/μl，混勻后，加入巰基乙醇(1 ml裂解液中加入60 μl巰基乙醇);(3)用封口膜封好EP管，95℃以上煮沸10 min、90℃左右微沸5 min，冷卻后可放于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4)蛋白濃度的測(cè)定嚴(yán)格按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書操作。結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的OD比值表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1AngⅡ?qū)UVEC增殖的抑制作用 HUVEC用不同濃度的 AngⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)給藥 24 h 作用后，各濃度AngⅡ?qū)UVEC的增殖都有抑制作用，有一定的濃度依賴性，濃度≥10-6mol/L時(shí)對(duì)HUVEC的增殖抑制作用更加顯著，AngⅡ10-4mol/L時(shí)細(xì)胞增殖被抑制了44%;給藥48 h后，AngⅡ誘導(dǎo)組各濃度對(duì)HUVEC的增殖都有抑制作用，有明顯的劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較，AngⅡ10-4mol/L時(shí)細(xì)胞的增殖被抑制了50%。因此，選取10-6mol/L作為AngⅡ最適實(shí)驗(yàn)濃度。見表1。

2.2藍(lán)莓花色苷對(duì)HUVEC增殖的影響 見表2。給藥24 h后，低濃度藍(lán)莓花色苷可輕度增加HUVEC的增殖作用，呈濃度依賴性，當(dāng)濃度≥40 μg/ml時(shí)對(duì)HUVEC的增殖出現(xiàn)抑制作用，也有一定的濃度依賴性，最高濃度使細(xì)胞增殖抑制了11%;給藥48 h后，藍(lán)莓花色苷濃度≥40 μg/ml時(shí)對(duì)HUVEC的增殖亦有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，最高濃度時(shí)細(xì)胞的增殖被抑制了11%。因此，本實(shí)驗(yàn)選取20 μg/ml作為藍(lán)莓花色苷的最適實(shí)驗(yàn)濃度。

表1AngⅡ?qū)UVEC增殖的抑制作用(x ± s，n=7)

表2 藍(lán)莓花色苷對(duì)HUVEC增殖的影響(x ± s，n=7)

2.3藍(lán)莓花色苷對(duì)Bax、Caspase-3的影響 藍(lán)莓花色苷能夠降低Bax的表達(dá)，抑制Caspase-3的激活。見圖1。

圖1 藍(lán)莓花色苷對(duì)Bax、Caspase-3的影響

3討論

隨著對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)生物功能的不斷認(rèn)識(shí)探究，認(rèn)為AS早期形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞功能的阻礙〔4〕。VEC損傷參與粥樣斑塊的形成，同時(shí)可誘發(fā)血管收縮及形成血栓，因此，VEC的損傷和凋亡被認(rèn)為是AS的觸發(fā)環(huán)節(jié)和早期最重要病變特征〔5〕。研究表明，AngⅡ可以通過增加血管內(nèi)膜的通透性，激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，增加黏附分子、炎癥趨化因子以及細(xì)胞因子的表達(dá)，引起LDL的攝取和氧化，并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)，直接滅活NO，氧化低密度脂蛋白(LDL)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激等促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究證明藍(lán)莓花色苷對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用;藍(lán)莓花色苷有抗氧化、保護(hù)VEC的功能，在AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，氧化應(yīng)激起著重要作用。綜上所述，本研究表明藍(lán)莓花色苷對(duì)HUVEC凋亡的抑制作用無論是細(xì)胞存活率方面，還是凋亡蛋白表達(dá)量方面都具有顯著變化，影響B(tài)ax、Caspase-3的表達(dá)、降低胞內(nèi)ROS也是其抗凋亡機(jī)制之一，從而影響ROS-NF-κB-Caspase-3通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。提示藍(lán)莓花色苷可能是重要的抗氧化藥物。

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