劉 榮 許能貴 (廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

研究證明，腦缺血損傷引起的細(xì)胞凋亡多與白介素、腫瘤壞死因等細(xì)胞因子有關(guān)，而JAK/STAT系統(tǒng)可能在以上因子發(fā)生作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的起重要作用〔1〕。JAK2作為酪氨酸蛋白激酶JAK家族的一員，參與了免疫、造血、神經(jīng)等系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后 JAK2磷酸化抑制劑AG490可以抑制JAK2的活化，下調(diào)STAT3的磷酸化水平，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞以及改善神經(jīng)功能缺損〔3〕。揚(yáng)謙梓等〔4〕在研究兔右側(cè)大腦中動(dòng)脈梗死模型中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，應(yīng)用JAKs酪氨酸磷酸化抑制劑AG490可改善大鼠神經(jīng)行為評(píng)分(NBS)并縮小其腦梗死面積。我們的前期研究工作已初步證實(shí)了，腦缺血后磷酸化JAK2、STAT3超量表達(dá)，JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活;而腦缺血后電針治療可下調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平，阻斷JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，這可能為電針治療腦缺血損傷、抑制神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制之一〔5～7〕。本實(shí)驗(yàn)探討酪氨酸激酶JAK2在腦缺血損傷中的作用，進(jìn)一步揭示電針治療缺血性腦疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠250只，雄性，體重180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0020。將動(dòng)物分為假手術(shù)組、模型組、電針組、AG490組、電針+AG490組，每組各50只，各組按造模后時(shí)間的不同分為2 h、1、3、7和21 d的5個(gè)時(shí)間段，每小組10只大鼠。

1.2主要試劑 AG490(德國(guó)Merck公司)、DMSO(美國(guó)Sigma公司)、大鼠JAK2原位雜交檢測(cè)試劑盒(針對(duì)大鼠JAK2靶基因的mRNA序列為:①5＇-GCCGC CACTG AGCAA AAAGG TAAGA CAT，②5＇-TCGCT CAACG GCAAA GGTCA GGAAG TAT)(天津?yàn)笊锕こ逃邢薰?、DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)、兔抗 p-JAK2多克隆抗體(美國(guó) Santa公司)、山羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Santa公司)。

1.3主要儀器 G6805-Ⅰ型電針儀(青島鑫升廠)、華佗牌無(wú)菌針灸針(0.3 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠)、932型電熱凝器(上海醫(yī)療器械八廠)、Leica冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、大鼠大腦立體定位儀(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)、蔡司AxioCam-MR顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.4方法

1.4.1局灶性腦缺血模型制備 采用熱凝閉大腦中動(dòng)脈致局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛溶液，按0.33 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。取右側(cè)臥位固定，沿耳眼連線中點(diǎn)切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨做一骨窗，輕抬腦，顯露大腦中動(dòng)脈，用932型電熱凝器輕觸大腦中動(dòng)脈，使之凝閉，造成局灶性腦缺血模型。其中假手術(shù)組只手術(shù)暴露大鼠大腦中動(dòng)脈，不予凝閉。

1.4.2治療方法 電針組術(shù)后給予電針治療，選取“百會(huì)”、“大椎”兩穴。兩穴接上電針，用疏密波，疏密波調(diào)制頻率為20次/min，電流強(qiáng)度約1～2 mA，以大鼠安靜耐受為度，時(shí)間30 min，1 次/d。

1.4.3AG490側(cè)腦室注射 將AG490溶解于3%二甲基亞砜(DMSO)溶液中。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)麻醉后，于立體定向儀上固定門齒與兩外耳道。頭頂皮膚剃毛，消毒后切開顱頂皮膚。鈍性分離筋膜，暴露Bregma點(diǎn)，并以黑墨水標(biāo)記。進(jìn)針點(diǎn)位于Bregma點(diǎn)后0.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.5 mm。用注射器針頭在定點(diǎn)上鉆孔，保證將顱骨鉆透但不傷及腦實(shí)質(zhì)。消毒棉球止血，干燥術(shù)野后，將裝載有10 μl藥物的25 μl微量注射器(尖端連接玻璃電極)與立體定向儀連接，針深至腹側(cè)4.8 mm。進(jìn)入側(cè)腦室后，緩慢勻速推注藥物，時(shí)間為10 min，再留針2 min。

1.5神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用Zea-Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，其中1～4分為動(dòng)物缺血模型成功的標(biāo)志。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:無(wú)任何神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向缺血灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺損，站立時(shí)向缺血灶對(duì)側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.6JAK2 mRNA原位雜交 將冰凍切片置過氧化氫封閉液室溫20 min，以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶。0.01 mol/L PBS清洗5 min×1。滴加消化工作液，覆蓋組織表面，室溫20 min。0.01 mol/L PBS清洗5 min×3。0.2×SSC洗滌3 min×1。滴加預(yù)雜交工作液覆蓋組織37℃濕盒孵育1 h。預(yù)雜交后的洗滌-揭去蓋玻片以0.2×SSC洗滌5 min×3。滴加雜交工作液(含探針5 μg/ml)覆蓋組織37℃濕盒孵育2 h。雜交后的洗滌-揭去蓋玻片以0.2×SSC洗滌5 min×3，0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3。滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液，覆蓋組織37℃濕盒孵育45 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3。滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復(fù)合物工作液。覆蓋組織37℃濕盒孵育45 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3。DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察至細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)陽(yáng)性顏色與細(xì)胞外背景顏色對(duì)比度反差明顯時(shí)蒸餾水洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，胞核為藍(lán)色。梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)脫水，5 min/次，二甲苯透明3 min×2，中性樹膠封片保留。應(yīng)用Image-ProPluse 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 見表1。假手術(shù)組大鼠各時(shí)段神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分。在腦缺血不同時(shí)間段方面，腦缺血1 d時(shí)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與其他時(shí)間段相比處于較高水平。在不同處理方面，模型組的分值最高，除21 d組外，與電針組、AG490組及AG490+電針組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。缺血后3 d模型組大鼠神經(jīng)功能缺損有所減輕，部分大鼠向病灶對(duì)側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，與假手術(shù)組比較有顯著差異(P＜0.01)，而電針組、AG490組和AG490+電針組大鼠神經(jīng)缺損功能逐漸恢復(fù)，評(píng)分明顯低于同時(shí)間段模型組(P＜0.01)，但3組間評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺血7 d后，各組大鼠神經(jīng)功能缺損狀況有所改善，其中電針組、AG490組和AG490+電針組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與同時(shí)間段模型組相比均降低(P＜0.05)。21 d后模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分繼續(xù)下降，與假手術(shù)組比較仍有顯著差異(P＜0.01)，但模型組、電針組、AG490組和AG490+電針組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(x ± s，n=10)

2.2缺血灶大腦皮質(zhì)JAK2 mRNA表達(dá) 各時(shí)段的假手術(shù)組均只有極少量JAK2 mRNA表達(dá)。缺血2 h后其他各組JAK2 mRNA水平即開始升高，與同時(shí)段假手術(shù)組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，其中又以模型組升高最明顯，與 AG490組、AG490+電針組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。除假手術(shù)組，缺血1 d后各組均升高達(dá)到峰值，模型組最為顯著，電針組次之，AG490組及AG490+電針組也達(dá)到組內(nèi)峰值。電針組、AG490組及AG490+電針組JAK2 mRNA表達(dá)比模型組顯著降低 (P＜0.01)(圖1)。各組在缺血3 d后JAK2 mRNA水平開始下降，7 d后各組均持續(xù)下降，電針組、AG490組及AG490+電針組仍明顯低于模型組 (P＜0.01)。除假手術(shù)組，到了缺血后21 d各組JAK2 mRNA表達(dá)水平差異不明顯 (P＞0.05)，見表2。

圖1 腦缺血后1 d各組局灶性腦缺血大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)JAK2 mRNA表達(dá)(DAB，×400)

表2 各組大鼠JAK2 mRNA表達(dá)比較(x ± s，n=10)

3討論

JAKs激酶為JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，其是許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的重要信號(hào)傳感器。JAKs激酶不僅在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，也是腦缺血后的炎性反應(yīng)、決定病灶區(qū)細(xì)胞凋亡進(jìn)程的重要因素。

JAK2是JAK家族中較為重要的一個(gè)成員，其與STAT家族的多個(gè)成員共同構(gòu)成了多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如JAK2/STAT3、JAK2/STAT5等〔8〕。腦缺血時(shí)能引起大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的釋放，這些因子能夠激活JAK2的表達(dá)，從而作用于其下游因子STAT，使其磷酸化。本研究發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血大鼠模型中再灌注6～72 h的缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體中，磷酸化JAK2表達(dá)增多，在腦缺血后磷酸化JAK2的陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。此外，腦內(nèi)注射AG490可以阻止缺血后JAK2活化，并可以明顯地縮小病變區(qū)域梗死的體積和減輕細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能的缺失〔8〕。

神經(jīng)功能缺損是評(píng)價(jià)局灶性腦缺血以及缺血性腦損害最重要的終末指標(biāo)之一。研究中神經(jīng)行為學(xué)觀察性評(píng)分指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)減少、前肢屈曲、肌力下降、身體旋轉(zhuǎn)、側(cè)傾姿勢(shì)、呼吸窘迫等，此評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)能較客觀地分析腦缺血后神經(jīng)功能障礙程度。本研究提示腦缺血后JAK2超量表達(dá)及活化在腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中起著決定性的作用，電針治療能有效抑制JAK2的超量表達(dá)，從而阻斷JAK2誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，這可能為電針治療腦缺血損傷、抑制神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制之一。對(duì)于腦缺血損傷后JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及“針刺刺激-信號(hào)調(diào)節(jié)-神經(jīng)自穩(wěn)態(tài)啟動(dòng)”的確切途經(jīng)和機(jī)制是我們進(jìn)一步探索深化研究的方向。

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