王慧霞 詹向紅 李 偉 劉勝利 王有杰 于華林 伍盼盼 孫前明 潘玉穎

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

伴隨社會應(yīng)激事件頻頻發(fā)生，人們感受到越來越多的緊張，由此引發(fā)的情緒問題也日益增多，情緒沖突已成為多種疾病發(fā)病率升高的重要原因之一，并在引起老年相關(guān)疾病的過程中起重要作用。國外報道顯示經(jīng)常遭受負(fù)性情緒應(yīng)激的個體記憶力更易減退〔1〕，本課題組前期研究結(jié)果也顯示，單一憤怒情緒可加速腦老化〔2〕。然而，有學(xué)者〔3〕對情志病患者研究發(fā)現(xiàn)，兩種或兩種以上負(fù)性情緒共同致病者占全部病例的88.97%，即多情交織共同致病更為常見。那么，多種負(fù)性情緒長期積累對腦老化進(jìn)程會產(chǎn)生怎樣的影響，其機(jī)制如何?本課題以負(fù)性情緒為切入點，試圖建立負(fù)性情緒應(yīng)激大鼠模型，為情緒應(yīng)激動物模型的研制開拓新思路，并為情志內(nèi)傷理論增添新的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠70只，SPF級3月齡，雌雄各35只，雄鼠體重(360±10)g，雌鼠體重(300±10)g，購于山東魯抗公司(SCXK(魯)2013-0001)。在河南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心IVC環(huán)境動物實驗室(SYXK(豫)2012-0009)進(jìn)行實驗，并由該實驗室提供標(biāo)準(zhǔn)實驗動物滅菌墊料。所有的實驗過程經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行。正常飼養(yǎng)1 w后，按體重和曠場實驗得分，剔除結(jié)果偏離大的個體，余下的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、D-半乳糖(D-gal)衰老及腦老化組(D-gal組)、負(fù)性情緒應(yīng)激組(應(yīng)激組)、D-gal+負(fù)性情緒應(yīng)激組(應(yīng)激D-gal組)，每組14只，雌雄各半，其余作為攻擊鼠。各組雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.1.2主要實驗儀器及試劑 曠場實驗箱(上海欣軟信息科技有限公司);Smart視頻圖像跟蹤分析系統(tǒng)(Media Cybernetics.Inc);Nikon單反數(shù)碼攝像機(jī)(日本尼康);PK-DS-112U頻閃儀(上海臨宜電氣設(shè)備有限公司);HY-2調(diào)速多用振蕩器(金壇市金城國勝實驗儀器廠);AES-340大鼠飲水沖突實驗系統(tǒng)(寧波市科技園區(qū)安來軟件科技有限公司);TDCG接觸式調(diào)壓器(金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠);全波長自動酶標(biāo)分析儀、1575自動酶標(biāo)洗板機(jī)(美國Thermo Scientific公司);大鼠血漿NE酶免試劑盒、5-羥色胺(5-HT)酶免試劑盒(美國R＆D公司，批號:14-02);大鼠血漿多巴胺(DA)酶免試劑盒(美國R＆D公司，批號:13-12);D-gal(美國 Amresco公司，批號:20130806);生理鹽水(竹林眾生制藥廠，批號:20130915);蔗糖(北京化學(xué)試劑公司，批號:20131106)。

1.2方法

1.2.1衰老模型復(fù)制 參考文獻(xiàn)〔4〕方法:將大量的D-gal粉末溶于生理鹽水，配制濃度為2%D-gal，并滅菌以備用。采用頸背部皮下多點注射，注射容量為1 ml/100 g，1次/d;空白對照組注射同等體積生理鹽水，連續(xù)6 w。每周測1次體重，根據(jù)測得體重計算注射容量。

1.2.2負(fù)性情緒應(yīng)激引入 采用不可預(yù)知性心理應(yīng)激(CUMS)誘導(dǎo)方法，應(yīng)激組、應(yīng)激D-gal組分別接受28 d八種不同的應(yīng)激，分別為束縛(6 h/d)、溫水游泳(水桶高50 cm，直徑30 cm，水深30 cm，溫度為 23℃ ±0.5℃，15 min/d)、間接電擊(電壓 40 V，1 ～2 次/min，15 min/d)、搖晃(160 次/min，30 min/d)、強(qiáng)光(300閃光/min，5 h/d)、潮濕墊料(每 100 g墊料灑入 250 ml水，12 h/d)、噪聲(90 dB，3 h/d)、懲罰性飲水(0.5 mA，10 min)，每天1種，隨機(jī)出現(xiàn)。

1.2.3曠場實驗 應(yīng)激結(jié)束后，一個實驗人員握住大鼠尾根部1/3處，小心放入曠場正中格，另一個實驗人員電腦操作Smart視頻跟蹤系統(tǒng)，自動記錄動物3 min的行為變化及得分:①水平得分:動物穿越底面方格(四爪均進(jìn)入的方格計數(shù));②垂直得分:直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁);③曠場實驗得分=①+②。同時記錄中央格停留時間、修飾次數(shù)、糞便粒數(shù)。實驗過程中及時用酒精擦拭其運(yùn)動軌跡，防止殘留氣味線索。

1.2.4糖水消耗實驗 大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗前訓(xùn)練動物適應(yīng)蔗糖水;第一個24 h，給予每只大鼠一瓶1%蔗糖水;第2天禁食禁水23 h，之后進(jìn)行正式實驗，即給予每只大鼠一瓶200 ml的1%蔗糖水，1 h后取走并用量筒稱取剩余糖水量，計算應(yīng)激前后每只動物的糖水消耗量〔5〕。

1.2.524 h攝食量測定 于應(yīng)激前和應(yīng)激結(jié)束后測量，早上8:00給每籠大鼠添加飼料200 g，選擇顆粒較大的飼料，以防止飼料過小掉入鼠籠引起實驗誤差，次日8:00稱量剩余飼料量，計算24 h各組大鼠攝食量〔6〕。

1.2.6標(biāo)本采集與制備 實驗第47天取材，按照0.3 ml/100 g注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血4～5 ml，裝于含乙二胺四乙酸(EDTA)鈉的抗凝管中，靜置、離心，吸取上清液，－70℃保存，用于測定大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮(CORT)、去甲腎上腺素(NE)、5-HT。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);組間兩兩比較，方差齊的資料采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。

2結(jié)果

2.1大鼠的行為表現(xiàn) 應(yīng)激前期，應(yīng)激組和應(yīng)激D-gal組大鼠精神緊張，毛發(fā)豎立，尖叫，個別大鼠與同伴打斗、撕咬;隨著應(yīng)激時間延長，大鼠毛發(fā)零亂，目光無神，籠內(nèi)大鼠緊挨，頭部蜷縮于身體中，飲水及攝食量明顯減少，夜間時有細(xì)聲尖叫。

2.2曠場實驗結(jié)果 各組曠場實驗基線得分無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。造模后，與空白對照組相比，應(yīng)激組大鼠曠場實驗水平得分、垂直得分及總分下降，中央格停留時間增加(P＜0.05)。見表1。

2.3糖水消耗量及24 h攝食量比較果 各組基線糖水消耗量及24 h攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，與空白對照組相比，應(yīng)激組大鼠造模后糖水消耗量、24 h攝食量減少(P＜0.05)。見表2。

2.4生化指標(biāo)檢測結(jié)果 與空白對照組相比，應(yīng)激組大鼠血漿ACTH、CORT、NE水平上升，5-HT水平下降(P＜0.05)。見表3。

表1 四組大鼠曠場實驗得分比較(x ± s，n=14)

表2 四組大鼠造模前后糖水消耗量及24 h攝食量比較(x ± s，n=14)

表3 四組大鼠血漿ACTH、CORT、NE、5-HT水平比較(x ±s，ng/L，n=14)

3討論

已有醫(yī)家將七情學(xué)說類比于應(yīng)激理論〔7〕，國外有研究報道顯示〔8〕，有暴力和幼年虐待經(jīng)歷會增加人們產(chǎn)生抑郁癥狀的風(fēng)險，負(fù)性應(yīng)激事件與不良的健康狀況相關(guān)〔9〕。這與中醫(yī)由情志不暢引起的肝郁證有相通之處，兩者共同闡述了在遭遇持續(xù)不良心理應(yīng)激時，個體內(nèi)部的心理及生理狀態(tài)發(fā)生變化，并最終累積形成肝氣郁結(jié)狀態(tài)的過程。情緒心理學(xué)中，抑郁比其他情緒都更為強(qiáng)烈持久，任何負(fù)性情緒體驗交織在心中長期積累并互相影響，最終會使機(jī)體處于壓抑、抑郁狀態(tài)中。

有學(xué)者〔10〕采用束縛、居住入侵〔11〕制作肝郁模型，但存在軀體應(yīng)激及模型復(fù)制成功率低等缺點，且應(yīng)激方法多為單一應(yīng)激方式持續(xù)作用于動物。本實驗發(fā)現(xiàn)，同一種刺激方式可使動物能預(yù)測到下一個刺激的產(chǎn)生并逃避，減弱應(yīng)激模型復(fù)制效果，應(yīng)激因子的不可預(yù)測性是動物逃避反應(yīng)缺失的關(guān)鍵〔12〕。

慢性輕度CUMS模型能較成功地誘發(fā)出以抑郁為主的負(fù)性情緒，應(yīng)激因子多樣化且不可預(yù)測，能避免單一刺激引起的適應(yīng)性，可應(yīng)用于慢性心理應(yīng)激的神經(jīng)生物學(xué)和行為心理學(xué)研究，但其中的電擊、禁水禁食對動物產(chǎn)生軀體應(yīng)激。因此，篩選出間接電擊、懲罰性飲水、噪聲、強(qiáng)光、搖晃、潮濕墊料、溫水游泳和束縛八種應(yīng)激因子，建立一個新的CUMS的誘導(dǎo)方法，每種應(yīng)激方式最大限度地減少了軀體應(yīng)激成分，所產(chǎn)生的心理應(yīng)激反應(yīng)相對純粹。應(yīng)激時間的長短可使模型所產(chǎn)生的情緒反應(yīng)類型不同，有文獻(xiàn)報道證實，短時間的應(yīng)激條件下動物產(chǎn)生的反應(yīng)以焦慮為主，長時間的應(yīng)激作用會使動物的抑郁成分顯著增加〔13〕。本實驗?zāi)康闹荚谘芯块L期負(fù)性情緒應(yīng)激對D-gal大鼠的影響，因此在模型的制備方面?zhèn)戎赜趯我粦?yīng)激因子的作用時間適當(dāng)延長。對于應(yīng)激動物的選擇，雄性動物容易受到社會等級等社會心理因素影響，而雌性動物較少感受到，雌性動物的生理條件對較弱的應(yīng)激更為敏感，因此，基于雌雄動物的應(yīng)激反應(yīng)差異以及女性的高情緒障礙罹患率，有必要將性別因素納入情緒應(yīng)激動物模型的研究設(shè)計中，以均衡性別對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。

本文結(jié)果提示慢性負(fù)性情緒應(yīng)激降低了大鼠的興奮性和探究趨勢及認(rèn)知功能。應(yīng)激組糖水消耗量減少，這與任利翔等〔14〕的研究結(jié)果一致。大鼠有嗜甜食的習(xí)慣，糖水消耗量下降反映出大鼠的“快感缺失”狀態(tài)，這與人類在負(fù)性情緒狀態(tài)下，對通常令人感到愉悅的事物缺乏愉快的情緒反應(yīng)相似。應(yīng)激組24 h攝食量減少，這與人類在負(fù)性情緒狀態(tài)時表現(xiàn)的食欲下降等癥狀相符，該現(xiàn)象可能為大鼠受到各種應(yīng)激因子作用致作息規(guī)律紊亂所致。

應(yīng)激反應(yīng)是指在應(yīng)激源的刺激下，個體所產(chǎn)生的生理、心理及行為反應(yīng)。在日常生活中，應(yīng)激源多種多樣，如社會環(huán)境、生活事件、自然災(zāi)害等。當(dāng)各種應(yīng)激源作用于人體時，機(jī)體會產(chǎn)生一系列以下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸為核心的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，參與其中的激素包括促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、ACTH和糖皮質(zhì)激素(GC)。HPA軸激活，下丘腦釋放的CRH升高，CRH的高分泌促進(jìn)了垂體ACTH水平上升，后者又作用于腎上腺皮質(zhì)，引起GC水平升高，應(yīng)激學(xué)說與中醫(yī)七情理論接近〔15〕，長期應(yīng)激導(dǎo)致抑郁可能是通過HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，皮質(zhì)醇升高并激動糖皮質(zhì)激素受體，最終破壞海馬神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致海馬體積縮小而發(fā)生的〔16〕。中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括NE，5-HT，DA。NE與應(yīng)激時情緒反應(yīng)相關(guān)，是交感-腎上腺-髓質(zhì)激活的主要指標(biāo)，血漿NE水平可反映外周交感神經(jīng)的功能。5-HT參與調(diào)節(jié)睡眠、情緒、記憶等行為，當(dāng)機(jī)體受到各種心理應(yīng)激時，大腦5-HT的合成和代謝產(chǎn)生變化，大量不同的受體系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)介導(dǎo)5-HT參與情緒的抑制控制過程，因此5-HT及其受體功能失調(diào)與抑郁等精神疾患相關(guān)。DA參與調(diào)控運(yùn)動、動機(jī)與獎賞、內(nèi)分泌等過程，DA能系統(tǒng)更多地涉及愉悅等正性心理過程，傳遞愉悅、興奮等信息。三類神經(jīng)遞質(zhì)參與不同的系統(tǒng)，它們之間相互制約，相互協(xié)調(diào)以維持機(jī)體正常的情緒活動和記憶功能，在一定程度上血漿中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變可以反映中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化。

應(yīng)激組大鼠血漿ACTH、CORT、NE水平升高，可能是因為負(fù)性情緒應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠的HPA軸和交感-腎上腺-髓質(zhì)的激活使體內(nèi)ACTH、CORT、NE大量釋放入血，該結(jié)論印證了嚴(yán)燦等〔17〕的研究結(jié)果;另外，許多學(xué)者認(rèn)為肝郁證是由5-HT功能低下所致〔18〕，由此可推斷大鼠在應(yīng)激之后的狀態(tài)為肝郁證。

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