張振強 呂歡歡 賈亞泉 宋軍營 李澎濤 潘彥舒 呂 靖

(河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450008)

缺血性腦血管疾病目前已經(jīng)成為嚴重危害人類健康三大疾病之一。而單純性腦缺血在臨床上發(fā)病率較低，多數(shù)是在高脂血癥、高血壓、糖尿病等高危因素條件下發(fā)生的，在基礎(chǔ)病變條件的影響下，缺血性腦病的病理生理過程雖然也伴隨有腦水腫、自由基損傷、炎癥反應、血液高凝狀態(tài)、神經(jīng)細胞壞死及凋亡等共同特征，但是也有一定的差異，如內(nèi)皮細胞和神經(jīng)功能損傷的程度、炎癥因子表達、神經(jīng)細胞凋亡的方式等并不是完全相同的。本文從單純腦缺血和高脂血癥合并腦缺血在超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管新生等方面進行對比，探討高脂血癥對缺血腦組織在不同時期相關(guān)因素的影響。

1 材料和方法

1.1動物與分組 健康 Wistar大鼠，雄性，SPF級，280～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號為:SCXK(京)2007-0001，質(zhì)量合格證號:0243109。適應性飼養(yǎng)1 w后，將其隨機分為正常對照組、高脂血癥組、正常假手術(shù)組、高脂血癥假手術(shù)組、單純腦缺血組(正常動物復制腦缺血模型)、復合腦缺血組(在高脂血癥基礎(chǔ)上復制腦缺血模型)。其中單純腦缺血組和復合腦缺血組設兩個時間組，分別為復制腦缺血模型手術(shù)后3 d和7 d，每組手術(shù)成功后10只。

1.2儀器與試劑 FA/JA-B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，YP1201N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，MK3型酶標儀(Thermo)，WELLWASH4MK2型洗板機(Thermo)，TDZ5-WS型自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)。水合氯醛(北京化學試劑公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(邁新公司)、EDTA緩沖液(邁新公司)、DAB顯色工作液(邁新公司)，SOD(美國 R＆D Systems公司)、MDA(美國R＆D Systems公司)，兔抗大鼠 ICAM-1抗體(武漢博士德公司)、聚合HRP標記抗兔 IgG(武漢博士德公司)、兔抗大鼠CD34抗體(武漢博士德公司)。

1.3實驗動物模型制備

1.3.1高脂血癥大鼠模型制備 正常對照組、正常假手術(shù)組、單純腦缺血組給予正常飼料飼養(yǎng);高脂血癥組、高脂血癥假手術(shù)組、復合腦缺血組用加工的高脂高糖飼料〔1〕(組成:80.8%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5% 白糖、3.5%膽固醇、0.5% 膽酸鈉、0.2% 丙硫氧嘧啶)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)4 w后斷尾取血檢測大鼠血脂值，以高脂飼料飼養(yǎng)組血脂檢測結(jié)果與正常飼料飼養(yǎng)組相比較具有顯著的區(qū)別，說明高脂血癥模型復制成功，否則繼續(xù)以高脂飼料飼養(yǎng)。

1.3.2大腦中動脈缺血模型制備 在高脂血癥模型復制成功后，于手術(shù)前禁食8 h，不禁水。根據(jù)Longa等〔2〕報道的利用線栓法建立局灶性大鼠中動脈栓塞腦缺血模型，具體操作方法如下:①10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后背位固定;②備皮，頸中切口，分離出左側(cè)的頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈三動脈，分別用無損動脈夾夾閉左側(cè)頸總動脈和頸內(nèi)動脈;③用眼科剪在頸外動脈遠端剪一楔形小口，由此插入線栓(直徑約0.25 mm，頭端加熱呈直徑約0.3 mm的圓球形)使之由頸外動脈通過分叉部進入頸內(nèi)動脈到大腦中動脈的起點，插入線栓長度約18～22 mm，使大腦中動脈的血液供應阻斷;④適量青霉素對手術(shù)切口處消炎后縫合。正常假手術(shù)組和高脂血癥假手術(shù)組只結(jié)扎游離頸外動脈。⑤術(shù)后，保持動物體溫，在蘇醒后進行行為功能的觀察與評分，根據(jù)評分結(jié)果進行下一步實驗。

1.4行為功能的觀察與評分 大鼠手術(shù)蘇醒后和取組織前分別進行行為功能評分。評分的判定標準依照Longa的5級評分方法進行評分:0分:無體征，大鼠自由活動;1分:動物左側(cè)前肢不能完全伸展;2分:左前肢癱瘓，出現(xiàn)右旋追尾現(xiàn)象;3分:肢體癱瘓，不能站立;4分:動物昏迷，無自主性活動。其中評分結(jié)果為1～3分的動物可入組進一步實驗。

1.5酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測血清中SOD和MDA的含量模型制備成功后在相應時間點，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后背位固定，打開腹腔，從腹主動取血5 ml，置于10 ml普通采血管內(nèi)靜置30 min，在全自動平衡離心機上，3 000 r/min，離心15 min，取上清液1～3 ml依照 ELISA試劑盒檢測方法進行檢測。

1.6免疫組化法檢測高脂血癥合并腦缺血大鼠腦組織中ICAM-1和CD34的表達 模型制備成功后在相應時間點，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，背位固定，先行心臟灌注后，斷頭取出全腦。腦組織經(jīng)過常規(guī)脫水，蠟封，3%H2O237℃孵育10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液微波修復抗原12 min，室溫冷卻20 min以上;用正常羊血清工作液封閉，37℃20 min，除去多余封閉液，勿洗。兔多克隆抗體 ICAM-1(1∶200)和 CD34(1∶200)4℃冰箱孵育過夜，PBS 沖洗3次，每次5 min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);生物素標記二抗，37℃孵育60 min，HRP標記鏈親和素孵育60 min，DAB顯色液反應染色。蘇木精染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于40倍物鏡下拍照。實驗結(jié)果采用Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算平均光密度值。

1.7統(tǒng)計學方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1高脂血癥合并腦缺血大鼠血清MDA及SOD活性測定見表1。MDA的表達變化是:在單純腦缺血組和正常假手術(shù)組組內(nèi)比較，手術(shù)后3 d時的表達升高，(P＜0.05);而手術(shù)后7 d時的表達下降;在復合腦缺血組與高脂血癥假手術(shù)組組內(nèi)的比較，手術(shù)后3、7 d時的表達均呈下降趨勢，且兩組差異顯著(P＜0.05);而復合腦缺血組與單純腦缺血組組間比較，手術(shù)后3 d、7 d時表達均下降(P＜0.05)。SOD在各個腦缺血模型組隨缺血時間的延長均表現(xiàn)為活性降低，復合腦缺血組與高脂血癥假手術(shù)組和單純腦缺血組與正常假手術(shù)組的組內(nèi)比較，其數(shù)據(jù)間的差異均顯著(P＜0.05);但復合腦缺血組與單純腦缺血組組間進行比較，其實驗結(jié)果無明顯差異(P＞0.05)，但SOD與MDA的比值增大，通過比值結(jié)果時行比較其差異顯著(P＜0.05)。

表1 高脂血癥合并腦缺血大鼠血清MDA和SOD水平及組織ICAM-1、CD34表達比較(x ± s，n=5)

2.2高脂血癥合并腦缺血組織中ICAM-1和CD34的表達ICAM-1和CD34在腦缺血模型的各個時間點均為高表達，復合腦缺血組與高脂血癥假手術(shù)組和單純腦缺血組與正常假手術(shù)組的組內(nèi)比較，其組間的差異均顯著(P＜0.05);并且復合腦缺血組與單純腦缺血組組內(nèi)比較，表達增高，3、7 d組間差異顯著(P ＜0.05)。見表1 和圖1，圖2。

圖1 高脂血癥病理條件下腦缺血組織中ICAM-1的表達(DAB，×400)

圖2 高脂血癥病理條件下腦缺血組織中CD34的表達(DAB，×400)

3討論

缺血性腦血管多為腦血管痙攣或栓塞引起腦組織缺血缺氧而致能量耗竭、興奮性氨基酸釋放、細胞內(nèi)鈣超載、自由基的產(chǎn)生等，導致腦組織水腫、神經(jīng)細胞變性壞死，腦細胞的各種生物酶活性喪失或轉(zhuǎn)化為對腦細胞有損害的酶，線粒體破壞，功能喪失，溶酶體膜裂解，大量溶媒溢入細胞質(zhì)，促使腦細胞發(fā)生自溶。由此可見，自由基介導的自由基連鎖反應是腦缺血后繼發(fā)性損傷的重要環(huán)節(jié)之一〔3〕。

研究表明〔4〕，在人和動物的模型實驗研究中，在由缺血引起的腦卒中與活性氧的增加有關(guān)。SOD是體內(nèi)特異性清除過氧陰離子(O-2)的抗氧化酶，在生理狀態(tài)下，SOD可以及時地清除機體代謝產(chǎn)生的氧自由基，使細胞得到保護而免受損傷，因此，機體清除氧自由基的能力與SOD活性的高低有關(guān)〔5〕。作為抗氧化應激組成成分的SOD，SOD活性在腦缺血中的異常表達使腦部的紊亂進一步加劇〔6，7〕。SOD活性的表達增加，主要是通過抑制JNK(絲裂原激活蛋白激酶家族成員)信號通路，從而降低激活蛋白-1(AP-1)和核因子-κB(NF-κB)的活性而產(chǎn)生相應的抗氧化作用〔8，9〕。腦缺血后產(chǎn)生的自由基通過攻擊脂質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸，使之發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生MDA，導致脂膜損傷，通透性增加，各種細胞器解體，生物膜嚴重損傷〔10〕。MDA是作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量多少直接反映自由基損傷程度〔11〕。最近研究表明MDA作為氧化應激狀態(tài)下脂質(zhì)過氧化物的顯著性標記反映機體氧化應激水平。本研究結(jié)果顯示:在高脂血癥條件下MDA活性表達增高，SOD活性表達降低。在復合腦缺血狀態(tài)下，MDA活性相比高脂血癥條件下進一步增高，SOD活性表達降低;但在腦缺血7 d時，復合腦缺血組與單純腦缺血組相比較，SOD活性和MDA活性的比值增大，這提示在高脂血癥條件下，腦缺血隨缺血時間的延長在7 d時的抗自由基損傷的能力呈增強的趨勢。

ICAM-1是一種分子量為80～110 kD的細胞膜表面糖蛋白分子，其存在于細胞表面、介導細胞與細胞之間或細胞與基質(zhì)之間，其作為炎性反應標志物在腦缺血發(fā)生后的炎癥反應中起到始動作用。正常情況下，ICAM-1在血管內(nèi)皮細胞上呈低表達，腦缺血時，ICAM-1在血管內(nèi)皮細胞上明顯上調(diào)〔12〕。ICAM-1的過度表達可促進白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附、遷移和浸潤，并釋放蛋白酶及毒性氧化物，最終放大炎癥反應效應，加重神經(jīng)元壞死〔13〕。CD34是一種跨膜糖蛋白，在人和鼠血管內(nèi)皮祖細胞、造血干細胞及其他組織中能夠表達，有黏附、調(diào)控造血細胞增殖和分化以及促血管前內(nèi)皮細胞聚集并形成血管等功能〔14〕。CD34在炎癥、缺氧等因素作用下，通過結(jié)締組織、內(nèi)皮細胞、炎癥細胞等產(chǎn)生能夠促使血管內(nèi)皮細胞生長的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子(PDGF)等多種活性物質(zhì)，在毛細血管和細靜脈的基礎(chǔ)上誘導新生血管的形成，在腦缺血過程中起保護作用。通過前期研究表明:高脂血癥模型大鼠腦組織 ICAM-1和CD34表達均增多〔15〕。本研究結(jié)果顯示ICAM-1、CD34表達增高，且復合腦缺血組在缺血3、7 d均高于單純腦缺血組，差異顯著，這些結(jié)果表明復合腦缺血組新生血管增加明顯。高脂血癥和腦缺血均可誘發(fā)上述因子高表達，出現(xiàn)累積現(xiàn)象，但是否會產(chǎn)生累積效應而引起損傷加重，結(jié)合前期研究:在高脂血癥條件下，腦缺血大鼠在缺血不同時期血管調(diào)節(jié)因子表現(xiàn)出累積與特異性的表達的現(xiàn)象，可能在腦缺血恢復期有助于損傷的修復〔16〕;基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達的增加，可能對腦缺血后神經(jīng)元有修復和保護作用〔17〕。根據(jù)以上研究推測，3 d主要引起炎癥損傷，7 d參與損傷修復過程，但其確切機制尚需進一步的研究驗證。

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